【摘 要】
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产单核细胞李氏杆菌(Listeria Monocytogenes,LM),为革兰氏阳性细菌,为胞内寄生菌。不但能感染动物,也可以感染人类引发公共卫生问题。为做好江苏省肉羊的健康养殖、肉羊源相关病原的风险评估,该研究对江苏主要养羊地区进行了产单核细胞李氏杆菌的临床检测,并研制了针对产单核细胞李氏杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体。通过PCR方法,对2017-2019年江苏主要养羊地区采集的1036份羊源肛拭子
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产单核细胞李氏杆菌(Listeria Monocytogenes,LM),为革兰氏阳性细菌,为胞内寄生菌。不但能感染动物,也可以感染人类引发公共卫生问题。为做好江苏省肉羊的健康养殖、肉羊源相关病原的风险评估,该研究对江苏主要养羊地区进行了产单核细胞李氏杆菌的临床检测,并研制了针对产单核细胞李氏杆菌鞭毛蛋白的单克隆抗体。通过PCR方法,对2017-2019年江苏主要养羊地区采集的1036份羊源肛拭子样品进行临床快速检测,确定2份(0.19%)样品为产单核细胞李氏杆菌阳性;该结果表明了产单核细胞李氏杆菌在江苏的肉羊养殖中为低频率感染,流行率较低。取2份PCR检测阳样品用特异性培养基PALCAM琼脂进行细菌分离,获得2株疑似产单核细胞李氏杆菌(分别命名为JC8株、JC46株)。通过对分离株的质谱鉴定、生化分析,确定JC8株、JC46株细菌均为产单核细胞李氏杆菌。利用多重PCR对分离株进行血清型鉴定,2株分离株血清型均属于1/2a或3a型。生物被膜形成能力试验显示JC46株有弱生物被膜形成能力,JC8株无生物被膜形成能力。为指导江苏地区产单核细胞李氏杆菌感染的抗生素用药,对JC8株与JC46株细菌进行了药敏实验,结果表明2株细菌均对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、头孢拉定、林可霉素、罗红霉素以及阿奇霉素敏感,对多粘菌素和恩诺沙星耐药;JC8株对青霉素耐药,JC46株对青霉素敏感。FlaA为产单核细胞李氏杆菌的鞭毛蛋白,具有良好的抗原性,其抗体可用于该菌的检测。根据GenBank发布的FlaA基因(flaA)序列,设计1对特异性引物用于FlaA结构蛋白基因的扩增。使用PCR方法将其扩增并插入到pMD-18-T中进行克隆。经序列分析表明所扩增的FlaA结构蛋白基因与发表的序列一致。用BamH I与SamI将目的片段从pMD-18-T载体切出,并克隆至表达载体pGEX-6P-1;获得的质粒pGEX-6P-1-FlaA转化进大肠杆菌BL21(DE3)中。含有重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导表达后,在细菌裂解上清与沉淀中均表达,融合蛋白GST-FlaA(约55 kDa)。使用GST纯化柱纯化蛋白,用抗GST血清作为第一抗体,羊抗鼠IgG作为第二抗体进行Western-blot,结果显示融合蛋白可与抗GST血清发生反应。利用所得已纯化融合蛋白GST-FlaA作为免疫原,按照常规程序免疫6周龄BALB/c小鼠后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。通过间接ELISA筛选阳性细胞株,最终获得2株能够稳定分泌识别FlaA的单克隆抗体细胞株(3C4株和6F8株)。抗体亚类鉴定结果显示2株细胞产生的抗体亚类均为IgGl,轻链均为κ型。使用体内诱生法获得腹水,3C4株和6F8株细胞的腹水效价分别为1:256000、1:64000,且均能与FlaA包被抗原呈阳性反应,并与其他细菌无交叉反应。通过凝集试验,3C4株和6F8株单抗均能与产单核细胞李氏杆菌发生凝集反应。表明所制备的单抗可以用于产单核细胞李氏杆菌分离株的鉴定。
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