前脑是脊椎动物中枢神经系统中最重要也是最复杂的结构之一,其包含了大脑皮层、基底神经节、丘脑、下丘脑等结构。根据分泌的神经递质的不同,前脑的神经元主要可以分为谷氨酸能神经元（glutamatergic neurons）、γ-氨基丁酸能神经元（γ-GABAergic neurons）及胆碱能神经元（cholinergic neurons）等。这些神经元结构和功能的完整性对于维持人体正常神经生理至关重要。据有关文献报道,前脑神经元的缺陷和功能异常会导致认知、记忆、运动、情感等多种功能障碍,甚至会引起阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）、亨廷顿舞蹈病（Huntington’s disease,HD）等难治愈的神经退行性疾病,严重危害人类健康。但现阶段,对于神经退行性疾病尚无特别有效的治疗方式。近些年随着干细胞研究的进步,细胞替代治疗为缓解甚至治愈这些疾病带来了新的希望。但是要实现体外获得治疗神经退行性疾病的细胞需要解决一些关键的瓶颈问题,如:如何诱导干细胞分化为所需要的特定类型的神经元;如何在体外获得足量、可供移植且功能成熟的神经元等。近些年来,对前脑神经元发育和分化的分子基础的深入认识直接推动了利用多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）定向分化以及体细胞谱系重编程（lineage reprogramming）等手段获得前脑神经元等研究的发展,这使得获取大量前脑神经元成为可能。尽管已经有不少研究可以在体外诱导干细胞分化获得前脑神经元,但是通常存在耗时长、神经元纯度不高、以及成熟度不够等问题。因此,在体外快速、高效地获得成熟前脑神经元是近几年国内外的研究重点及趋势,这不论对于神经系统疾病新型药物筛选,或是推进细胞替代治疗的临床转化都意义重大。在PSCs分化过程中转染并表达分化靶细胞的核心转录因子可以有效促进干细胞的定向分化和提高靶细胞纯度,但是遗传操作的复杂性和安全性限制了该策略的广泛应用。近年来,利用活性小分子化合物调控细胞命运取得了重要进展。与基因修饰手段相比,小分子化合物以其高效安全、作用可逆、剂量效应高度可控等诸多优点逐渐在多能干细胞定向分化领域中显示出巨大优势。本课题组长期从事利用小分子化合物诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,h ESCs）定向分化的研究,前期的研究中成功利用小分子化合物在体外建立了可自我更新的原始神经干细胞;该原始神经干细胞可高效分化为多巴胺神经元,细胞移植后可以挽救帕金森大鼠模型的症状。首次实现了脊髓p MN区的OLIG2+神经祖细胞在体外的稳定自我更新,同时,通过定向诱导分化能够使该神经祖细胞在较短的时间内分化为成熟的脊髓运动神经元和少突胶质细胞。在本研究中,我们依据前脑神经元在体内发育的规律和相关调控信号,在单层贴壁培养的条件下,首先在经典的双重SMAD抑制方法的基础上利用化合物LGK974（porcupine抑制剂）抑制Wnt（wingless-related integration site）信号通路,在1周的时间里诱导h ESCs快速高效地分化为表达FOXG1（Forkhead box G1）、SOX2（SRY-box transcription factor 2）、N-Cadherin和Nestin的前脑神经祖细胞（forebrain neuroepithelial progenitors,f NEPs）。在此基础上,我们发现添加化合物Dasatinib（酪氨酸激酶抑制剂）有利于神经元的获得。随后,利用Smoothened激动剂SAG来激活Shh（sonic hedgehog）信号通路对该f NEPs进行腹侧化诱导,在20天的时间里即可获得较高纯度（>80%）的、具有内侧神经节隆起区（medial ganglionic eminence,MGE）来源的NKX2.1阳性的GABA能神经元,并且此时我们检测到了GABA能神经元的亚型生长抑素型（somatostatin,SST）和小清蛋白型（parvalbumin,PV）;同时,利用人重组蛋白SHH和SAG来共同激活Shh信号通路,在20天的时间里得到表达v ACh T（vascular acetylcholine transporter）的胆碱能神经元;而添加Hedgehog通路抑制剂GDC-0449在20天左右的时间里得到表达v Glu T2（vesicular glutamate transporter 2）的谷氨酸能神经元。经膜片钳技术的检测,我们培养体系得到的前脑GABA能神经元在体外具有电生理活性。而将分化两周的前脑GABA能神经前体细胞移植到免疫缺陷鼠体内,约6周可以在小鼠脑内检测到表达Neu N的成熟神经元,3个月可检测到移植细胞产生自发的兴奋性突触后电位（spontaneous excitatory postsynaptic potentials,s EPSCs）和自发的抑制性突触后电位（spontaneous inhibitory postsynaptic potentials,s IPSCs）。以上结果表明了h ESCs来源的前脑GABA能神经前体细胞能在小鼠体内分化为功能性的神经元。随后我们初步探究了抑制细胞周期能否进一步加速前脑神经元分化,结果发现在上述神经元快速分化体系中添加细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases 2,CDK2）的抑制剂前脑神经元的分化速度无显著影响,而CDK4/6和Aurora激酶的抑制则不利前脑神经元的分化。体内实验表明转录因子SP8（specificity protein 8）在前脑的区域化（patterning）中起着重要作用,尤其是对腹侧前脑细胞特性的维持至关重要,SP8在小鼠前脑的特异性敲除抑制了NKX2.1的表达并导致严重的LGE（lateral ganglionic eminence）和MGE发育缺陷。我们接下来期望利用建立的神经元快速分化诱导体系,在体外研究重现SP8敲除对MGE及该区域神经发育的影响。我们利用clustered regularly interspaced short palindromicrepeats-Cas9（CRISPR-Cas9）系统建立了SP8基因缺失的h ESCs细胞系,发现在h ESCs中敲除SP8基因后,对前脑祖细胞的诱导无明显影响,也未影响前脑祖细胞腹侧化后MGE标志分子NKX2.1的诱导。如何在体外快速获得前脑神经元,以及如何快速、便捷获得高纯度的特定类型的神经元一直是本领域尚未解决的难题。本研究构建了一个包含小分子化合物的成分明确的全新诱导培养体系,该培养体系能够在单层贴壁培养的条件下快速且高效地诱导h ESCs定向分化为成熟的前脑GABA能神经元、谷氨酸能神经元和胆碱能神经元。因此,我们建立的前脑神经元快速分化体系有助于推动神经退行性疾病的细胞治疗、疾病模型的建立以及个性化药物的研发。