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目的:探讨雷帕霉素（rapamycin,Rapa）对JAK2 V617F阳性HEL细胞外泌体中JAK2、ATP结合盒转运蛋白A3（ATP-binding cassette transporter A3,ABCA3）及免疫检查点程序性死亡因子1（programmed death-1,PD-1）及其配体1（programmed death ligand-1,PD-L1）的影响。观察Rapa对JAK2V617F突变阳性人红白血病HEL细胞外泌体数量、JAK2 m RNA、ABCA3 m RNA和PD-1/PD-L1的影响。探讨Rapa对HEL细胞外泌体生成的影响,以及对其外泌体中JAK2 m RNA、ABCA3 m RNA和PD-1/PD-L1表达的影响,为临床治疗JAK2 V617F阳性骨髓增殖性肿瘤提供理论依据。方法:1细胞培养和实验分组培养人红白血病HEL细胞株（该细胞株JAK2 V617F天然阳性）。实验分组:各浓度Rapa处理组和对照组。使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养对照组。Rapa处理组应用10%胎牛血清RPMI1640培养基培养并加入不同浓度Rapa。Rapa的终浓度分别为（10 nmol/L,50nmol/L,100 nmol/L）。外泌体相关实验时应用去外泌体小牛血清配置培养基,配置比例同前。2 Cell Counting Kit（CCK-8）方法,检测接受不同浓度Rapa处理不同时间后,各处理组HEL细胞的增殖抑制率。根据增殖抑制率确定后续外泌体实验的药物浓度及分组。3 Transwell小室迁移实验,检测Rapa作用24h后各组HEL细胞迁移能力。4应用碘化丙啶（propidium iodide,PI）对HEL细胞染色,荧光显微镜观察Rapa作用24h后各组细胞凋亡情况。5 Exo Cap?Streptavidin Kit外泌体提取试剂盒提取外泌体。提取出外泌体后应用蛋白印迹（Western blot）技术和流式细胞术检测外泌体特征蛋白的表达。6实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR）检测各组HEL细胞外泌体JAK2、ABCA3、PD-1和PD-L1的m RNA表达。7流式细胞术检测Rapa作用24h后HEL细胞外泌体PD-1/PD-L1的表达。结果:1 CCK-8检测HEL细胞增殖抑制率结果显示:终浓度为10 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L的Rapa作用细胞不同时间后,HEL细胞的增殖抑制率24h时分别为（18.93±2.68）%、（26.19±4.74）%、（29.44±3.31）%;48h时分别为（25.16±3.3）%、（32.22±1.77）%、（38.11±3.59）%;72h时分别为（33.33±4.6）%、（49.12±3.72）%、（55.16±4.14）%。不同浓度Rapa处理HEL细胞不同时间（24h、48h、72h）后,HEL细胞的增殖抑制率较对照组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。且随着Rapa浓度增大,HEL细胞增殖抑制率呈剂量依赖性增加。根据细胞增殖抑制率,选择应用浓度为10 nmol/L和50 nmol/L的Rapa进行后续外泌体相关实验。2 Transwell迁移实验检测HEL细胞迁移结果显示:不同终浓度各组Rapa干预24h后下室细胞数分别为对照组4.4±0.45×10~4/ml,10 nmol/L组4.1±0.41×10~4/m L,50 nmol/L组3.85±0.41×10~4/m L,100 nmol/L组3.3±0.48×10~4/m L。100 nmol/L组与对照组相比,有统计学差异（t=2.8957,P=0.0443）3荧光显微镜显示:随着Rapa浓度升高,细胞数量显著减少,细胞凋亡增加。50 nmol/L组和100 nmol/L组可以明显观察到细胞数量和体积均减小,核质固缩,凋亡小体形成,红色荧光细胞数量增加。4外泌体的鉴定蛋白印迹试验显示:Exo Cap?试剂盒提取的外泌体,表达CD9特征蛋白;流式细胞术结果显示:所提取外泌体表达CD63和CD81特征蛋白,证实试剂盒所提取为外泌体。5实时荧光定量聚合酶链反应检测HEL细胞外泌体中JAK2、ABCA3、PD-1和PD-L1的m RNA表达量。结果显示:浓度为0 nmol/L（对照组）,10nmol/L,50 nmol/L的Rapa处理HEL细胞24h后,其外泌体中JAK2 m RNA相对表达量分别为（1.112±0.107）、（0.455±0.089）和（0.292±0.059）;ABCA3 m RNA相对表达量分别为（1.041±0.053）、（0.416±0.076）和（0.192±0.013）;PD-1 m RNA相对表达量分别为（1.074±0.11）、（0.898±0.045）和（0.96±0.053）;PD-L1 m RNA相对表达量分别为（1.007±0.013）、（0.551±0.041）和（0.194±0.018）。10 nmol/L组和50 nmol/L组外泌体中JAK2、ABCA3、PD-L1相对表达量均下降,差异有统计学意义（P＜0.01）,且随药物浓度增加而降低,PD-1无明显变化。6流式细胞术检测外泌体PD-1和PD-L1的表达,结果显示:对照组、10 nmol/L组和50 nmol/L组Rapa作用24h后,其PD-1表达情况分别为:（76.66±0.70）、（78.14±0.64）和（77.33±0.27）;PD-L1表达情况分别为:（71.67±0.12）、（68.83±0.76）和（68.88±0.24）。与对照组相比,10 nmol/L组和50 nmol/L组外泌体PD-L1均明显降低（P＜0.05）,PD-1表达无明显变化,且PD-L1蛋白表达随药物浓度增加而减低。7外泌体数量变化:根据流式细胞术测得经不同浓度Rapa（对照组、10 nmol/L、50 nmol/L）处理HEL细胞24h后,同时表达外泌体特征蛋白CD63和CD81的磁珠比例分别为（97.16±0.26）、（87.46±0.39）、（85.24±0.23）。CD63荧光强度分别为（58.75±1.77）、（32.07±0.64）、（28.38±0.31）。CD81荧光强度分别为（128.45±2.22）、（85.33±1.74）、（79.03±1.4）。其中10 nmol/L组与50 nmol/L组中同时表达CD63和CD81蛋白的磁珠的比例较对照组明显减少,有统计学差异（P＜0.05）,表明外泌体数量减少。10 nmol/L组与50 nmol/L组中CD63和CD81荧光强度均较对照组减低,差异有统计学意义（P＜0.05）,且二者均随药物浓度增加而减低,显示外泌体数量减少。以上结果均表明,在加入Rapa后,HEL细胞所产生的外泌体数量减少。结论:1 Rapa能够抑制HEL细胞增殖,并促进细胞凋亡,且能够抑制HEL细胞的迁移能力。2 HEL细胞外泌体中存在JAK2 m RNA,显示HEL细胞可能通过外泌体传递JAK2突变基因信号。3 Rapa能够抑制外泌体分泌,且使外泌体JAK2、ABCA3、PD-L1m RNA的表达水平下调。4 Rapa能够抑制外泌体PD-L1蛋白表达,对PD-1蛋白表达影响不大。