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目的:有研究表明慢性应激是阿尔茨海默症症状加剧的危险因素,同时在中医中认为AD与肝郁相关。基于此我们提出采用疏肝解郁代表方逍遥散来改善慢性应激下AD模型的假设。逍遥散出自《太平惠民和剂局方》,有疏肝解郁、健脾养血的功效。课题组前期实验已证明逍遥散可以改善慢性应激下AD模型大鼠的相关行为学症状。故本实验以原代海马神经元为研究对象,利用叠氮钠和皮质酮来建立慢性应激下AD体外模型来进行逍遥散脑脊液的药理学研究,通过细胞免疫荧光实验、免疫印迹实验、qPCR实验等技术,来从蛋白、基因等层面来探讨慢性应激加重AD的机理和逍遥散的作用机制。方法:1.根据相关文献培养原代海马神经元细胞并于显微镜下观察24小时、48小时、72小时和5-7天的生长情况,同时进行免疫荧光法来鉴定所取的原代海马神经元细胞。2.利用CCK8法来检测不同时间段(12小时、24小时、36小时和48小时)、不同浓度叠氮钠(20、30、40、50、60、70、80 mM)和不同浓度皮质酮(12.5、25、50、100、200、400、600 uM)海马神经元的存活率,并根据此存活率筛选出合适的作用时间和作用浓度进行复合给药,确立造模方法。通过检测海马神经元的MAP-2蛋白荧光强度、线粒体膜电位和相关蛋白表达情况来验证慢性应激下AD体外模型的稳定性和可靠性。3.利用CCK8实验方法来检测正常组、复合模型组、5%空白脑脊液组、5%逍遥散脑脊液组、10%空白脑脊液组、10%逍遥散脑脊液组、20%空白脑脊液组、20%逍遥散脑脊液组、米非司酮组海马神经元的存活率,同时采用细胞免疫荧光法来检测不同组别中海马神经元MAP-2蛋白的荧光强度。另外利用蛋白免疫印迹法来检测APP和GR蛋白的表达量来验证逍遥散不同浓度脑脊液的药效。4.利用CCK8实验方法来检测正常组、复合模型组、米非司酮组、逍遥散水提部位组、逍遥散乙酸乙酯部位组、逍遥散石油醚部位组海马神经元的存活率,同时也采用细胞免疫荧光法来检测不同组别中海马神经元MAP-2蛋白的荧光强度。另外利用蛋白免疫印迹法来检测APP和GR蛋白的表达量来筛选出逍遥散缓解慢性应激下AD复合模型病症的有效部位。5.通过蛋白免疫印迹实验和qPCR实验来研究逍遥散对海马神经元中FKBP51、FKBP52、GR和BDNF蛋白以及mRNA表达的影响。结果:1.新生SD大鼠海马神经元原代培养与鉴定(1)形态学观察:海马神经元种植4小时后,少部分细胞开始贴壁,单个均匀分布,形态为圆形、椭圆形和梭形;培养24小时后,细胞生长状态良好,多数细胞长出双突起或多个突起;培养48小时后,神经元细胞胞体增大,细胞质丰富,突起明显延长,初具神经元网络;培养5天后,神经元细胞分化更加成熟,胞体饱满,具有折光性,神经元之间突起的联系更加紧密,而且细胞之间出现聚集的现象。(2)免疫荧光鉴定:海马神经元胞体饱满,突触粗大,有复杂神经元网络,经鉴定细胞纯度在90%以上。2.慢性应激下AD体外模型的建立(1)细胞存活率实验:采用CCK8法进行筛选初步获得叠氮钠的干预时间为12小时,皮质酮的干预时间为24小时,通过细胞存活率实验最终确定叠氮钠的作用浓度为30 mM,皮质酮的作用浓度为100 uM。(2)免疫荧光实验:与正常组相比,叠氮钠组、皮质酮组和复合模型组的免疫荧光强度均明显下降,且以复合模型组下降程度为最大(P<0.01)。(3)线粒体膜电位:与正常组相比,叠氮钠组和复合模型组的JC-1聚合物/JC-1单体的比值明显降低(P<0.01),线粒体膜电位明显降低。(4)免疫印迹实验:与正常组相比,皮质酮组和复合模型组GR蛋白表达量均明显减少(P<0.01),叠氮组和复合模型组APP蛋白表达量则明显增加(P<0.01),且以复合模型组APP表达量增加更为明显。3.逍遥散对慢性应激下AD体外模型的药效学研究(1)细胞存活率实验:与正常组相比,复合模型组海马神经元存活率明显下降(P<0.01);与复合模型组相比,米非司酮组海马神经元存活率明显增加(P<0.01);与相应浓度的空白脑脊液组相比,逍遥散脑脊液组(10%、20%)海马神经元细胞的存活率均增加(P<0.05,P<0.01)。(2)细胞免疫荧光实验:与正常组相比,复合模型组MAP-2蛋白荧光强度明显减弱,光密度比值明显降低(P<0.01);与复合模型组相比,米非司酮组神经元的MAP-2蛋白荧光强度明显增强,光密度比值也明显增强(P<0.01);与相应浓度的空白脑脊液组相比,逍遥散脑脊液组(10%、20%)MAP-2蛋白荧光强度均明显增强,光密度值升高(P<0.01)。(3)蛋白免疫印迹实验:与正常组相比,复合模型组APP蛋白表达量明显增加而GR蛋白表达量明显降低(P<0.01)。与复合模型组相比,米非司酮组、不同浓度空白脑脊液组APP蛋白均显著降低(P<0.01),但米非司酮组、不同浓度空白脑脊液GR蛋白表达量均明显增加(P<0.01)。与相应浓度的空白脑脊液组相比,逍遥散脑脊液组(5%、10%、20%)均可增加GR蛋白的表达量(P<0.05,P<0.01,P<0.01),同时也可减少APP蛋白的表达量(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。4.逍遥散缓解慢性应激下AD体外模型有效部位的筛选(1)细胞存活率实验:与正常组相比,复合模型组海马神经元存活率明显下降(P<0.01);与复合模型组相比,米非司酮组、空白脑脊液组细胞存活率均明显增加(P<0.01)。与空白脑脊液组相比,逍遥散石油醚部位组细胞存活率明显增加(P<0.01)。(2)细胞免疫荧光实验:与正常组相比,复合模型组细胞MAP-2荧光强度明显减弱(P<0.01)。与复合模型组相比,米非司酮组和空白脑脊液组细胞MAP-2荧光强度均明显增强(P<0.01)。与空白脑脊液组相比,逍遥散石油醚部位组细胞MAP-2荧光强度明显增强,而逍遥散乙酸乙酯部位和水提部位均无明显变化。(3)蛋白免疫印迹实验:与正常组相比,复合模型组APP蛋白表达量明显增加但GR蛋白表达量明显降低(P<0.01)。与复合模型组相比,米非司酮组、逍遥散水提部位组、逍遥散乙酸乙酯部位组和石油醚部位组APP蛋白表达量均明显降低(P<0.01),其中逍遥散石油醚部位组在提取部位中降低程度最大,米非司酮组、逍遥散乙酸乙酯部位组和逍遥散石油醚部位组的GR表达量均明显升高(P<0.01)。5.逍遥散对慢性应激下AD体外模型的干预机制研究(1)蛋白免疫印迹实验:与正常组相比,复合模型组FKBP52和BDNF蛋白表达量均明显降低(P<0.01),而FKBP51蛋白表达量明显增加(P<0.01)。与复合模型组相比,逍遥散石油醚部位组FKBP52和BDNF蛋白表达量均明显增加(P<0.01),但FKBP51蛋白表达量降低(P<0.05)。(2)qPCR实验:与正常组相比,复合模型组GR、FKBP52和BDNF的mRNA相对表达量明显降低(P<0.01),APP和FKBP51的mRNA相对表达量明显增加(P<0.01)。逍遥散石油醚部位组APP和FKBP51的mRNA相对表达量明显降低(P<0.01),GR和BDNF的mRNA相对表达量增加(P<0.05),FKBP52的相对表达量明显增加(P<0.01)。结论:本研究摸索建立了慢性应激下AD体外模型,验证逍遥散可以缓解慢性应激下AD体外模型的损伤,且作用效果具有一定的剂量依赖性,其中以20%的逍遥散脑脊液效果为较好。同时确立了逍遥散中可以缓解此复合模型损伤的主要成分可能集中在石油醚部位,有效部位是石油醚部位。本研究通过分子生物学实验进行机制研究推测逍遥散可能是通过提高GR、FKBP52、BDNF的表达,降低APP和FKBP51的表达,实现对海马神经元的保护,从而缓解该复合模型的损伤。