研究背景肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。肺癌中80%是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer. NSCLC),病理上以鳞癌、腺癌和大细胞癌为主。因此研究肺癌的发生发展机制,寻找有效的治疗靶点,对于改善NSCLC预后,实施个体化治疗尤为重要。钙离子(Ca2+)作为第二信使,在细胞信号传导通路中起着重要的作用,调控细胞周期、分化、增殖和凋亡。近年来关于钙池操纵性钙通道(SOCC)的研究越来越多,由SOCC介导的钙池操纵性钙内流(SOCE)是非兴奋细胞例如上皮细胞产生Ca2+内流的主要方式。研究发现SOCE信号通路中的SITM1及ORAI1蛋白,由于其在介导SOCE中的作用而受到广泛关注。STIM1主要存在于细胞内质网膜上,在钙池消耗后,它作为一种“钙池信号感受蛋白”感受钙池充盈状态,并聚集成"puncta"向细胞膜移动靠近,而非嵌入到细胞膜中,此后STIM1通过羧基端与细胞膜上的SOCC通道蛋白如ORAI1的相互作用而开放钙通道,形成SOCE。STIM1和oRAI1介导的SOCE对上皮细胞的增殖、分化至关重要,因为多数肿瘤来源于上皮细胞,它们在肿瘤细胞中也陆续有相关的研究报道出现。NSCLC多来源于支气管上皮细胞,因此我们选择人肺腺癌细胞A549,研究SOCE在肺癌细胞中的表达情况；研究STIM1/ORAI1介导的SOCE对肺癌细胞的生物学行为如增殖、迁移和侵袭功能的影响；研究NSCLC患者手术肿瘤组织中STIM1或ORAI1表达和生存预后的关系。研究目的首先研究人NSCLC肿瘤组织中的SOCC通道STIM1和ORAI1的mRNA表达情况；其次在人肺腺癌细胞系A549中,研究SOCE与细胞增殖、迁移和侵袭的关系；然后研究STIM1和ORAI1蛋白在A549细胞增殖、迁移和侵袭功能中的作用；最后研究NSCLC患者手术肿瘤组织中STIM1或ORAI1蛋白表达和生存预后的关系。研究方法1、我们共收集2007-2009年NSCLC术后肿瘤组织和配对远癌正常肺组织(距肿瘤>5cm)24例,标本来自于广州医学院第一附属医院呼吸疾病研究所胸心外科。所有患者术前未行放化疗和其他抗肿瘤治疗。采用Trizol法提取组织总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR方法检测组织STIM1和ORAI1mRNA表达。2、人肺腺癌A549细胞,人支气管上皮细胞16HBE购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞增殖实验中,A549细胞和16HBE细胞中分别加入SOCE抑制剂SKF-96365或NiCl2。应用罗氏公司WST-1细胞增殖检测试剂盒检测24、48、72h的OD值,细胞增殖抑制率=1-实验组OD值／正常对照组OD值。A549细胞迁移和侵袭实验是应用Transwell小室法,迁移率=细胞迁移总数-上层未迁移细胞数／细胞总数,侵袭时检测迁移到Transwell小室的下室的细胞数。SOCE细胞钙功能测定是应用Fura-2Am荧光素方法检测,InCytIm2软件收集数据和分析。3、我们设计合成siRNA, Nucleofector细胞核转染方法瞬时沉默STIMIIORAH基因表达,然后检测A549细胞的增殖、迁移和侵袭功能的改变,余检测方法同上。4、我们应用S-P免疫组化方法检测70例ⅢA期NSCLC患者手术肿瘤组织STIM1和0RAI1蛋白表达,统计学分析和患者无疾病生存预后的关系。研究结果1.NSCLC肿瘤组织中STIM1/ORAI1mRNA的表达24例患者肿瘤组织STIM1mRNA相对表达量中位值0.84(0.19-3.4),1.09±0.82(X±S)；正常组织STIM1mRNA相对表达量中位值0.83(0.33-2.6)0.91±0.51(P>0.05)。17例患者肿瘤组织ORAI1mRNA相对表达量中位值0.95(0.31-4.9),1.51±1.46；正常肺组织ORAI1mKNA相对表达量中位值0.76(0.31-4.0),1.0±0.92(P>0.05)。在亚组分析中,我们发现腺癌和鳞癌之间的STIM1、ORAI1mKNA的表达无统计学差异(P>0.05),但腺癌的STIM1表达有高于鳞癌的趋势(P=0.055)；低分化肿瘤组织中ORAI1表达要高于分化较好的肿瘤和正常肺组织(P=0.028<0.05),而STIM1却没有类似发现。2.SOCE对A549肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响2.1A549和16HBE细胞的SOCE在含钙PSS溶液灌流后,不同浓度的SKF-96365和NiCl2都可以减少钙内流,并呈浓度依赖性。我们选取8-14个细胞,相对于未处理过的A549细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,482±36nM), SKF-96365处理过的细胞出现△[Ca2+]i下降(P<0.001)：其中SKF-963651μM (372±17nM);10μM (268±26nM);50μM (188±23nM)。相对于未处理的A549细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,482±36nM), NiCl2处理过的细胞出现△[Ca2+]i下降(P<0.001)：其中NiCl250μM(268±33nM);200μM (250±55nM);500μM(208±47nM)。在含钙PSS溶液灌流后,低浓度的SKF-96365增加16HBE细胞钙内流,但高浓度的SKF-96365才减少细胞钙内流。我们选取9-11个细胞,相对于未处理过的16HBE细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,290±53nM),低浓度SKF-96365处理过的细胞出现△[Ca2+]i上升(P<0.001)：其中SKF-963651μM (743±93nM);10μM (510±32nM),但高浓度SKF-9636550μM处理后细胞钙内流减少(180±29nM)。相对于未处理过的16HBE细胞(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,460±45nM), NiCl2处理过的细胞出现△[Ca2+]i下降(P<0.001)：其中NiCl2200μM (337±37nM);500μM(173±28nM);1000μM(58±6.1nM)。2.2SOCE抑制剂处理后的A549和16HBE细胞增殖实验我们首先选择不同浓度SKF-96365处理A549细胞,48h后观察细胞增殖抑制率,结果显示：SKF-963651μM(33%±5%);10μM(46%±4%);50μM(58%±1%),因此我们选择SKF-9636510μM进行下一步的实验。A549细胞经过SKF-9636510μM处理24h、48h和72h,我们发现不同时间点细胞的增殖受到明显的抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为20%±3%,52%±4%,73%±6%。16HBE细胞经过SKF-9636510μM处理24h、48h和72h,发现不同时间点细胞的增殖受到抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为14%±4%,38%±7%；67%±3%。我们首先选择不同浓度NiCl2处理A549细胞,48h后观察细胞增殖抑制率,结果显示：NiCl2200μM (44%±3%);500μM (50%±4%);1000μM(64%±10%),因此我们选择NiCl2500μM进行下一步的实验。A549细胞经过NiCl2500μM处理24h、48h和72h,我们发现不同时间点细胞的增殖受到抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为12%±4%,50%±4%,62%±9%。16HBE细胞经过NiCl2500μM处理24h、48h和72h,我们发现不同时间点细胞的增殖受到抑制,在24h、48h和72h的抑制率分别为14%±4%,43%±3%,63%±4%。2.3SOCE抑制剂处理后的A549细胞的迁移和侵袭我们在预实验中发现A549细胞有迁移能力,而16HBE细胞无迁移能力。我们发现不同浓度的SKF-96365和NiCl2可以明显抑制A549细胞的迁移。相对于未处理过的A549细胞(迁移率,49%±3%),SKF-96365处理后的A549细胞的迁移率降低：SKF-963651μM(20%±3%);10μM(10%±2%);50μM(8%±2%)(P<0.001)。相对于未处理过的A549细胞(迁移率,47%±2%),NiCl250μM (32%±6%);200μM (30%±5%);500μM (19%±4%);1000μM(11%±4%)(P<0.001)。实验中,我们还发现低浓度的SKF-963651μM和NiCl250μM都可以明显抑制A549细胞的迁移。不同浓度的SKF-96365和NiCl2可以明显抑制A549细胞的侵袭。相对于未处理过的A549细胞(6个视野迁移细胞,503±45个),SKF-96365处理后的A549细胞的迁移细胞减少：SKF-963651μM(210±36个)；10μM(110±26个)；50μM(20±5个)(P<0.001)。相对于未处理过的A549细胞(6个视野迁移细胞,503±45个),NiCl2200μM(396±55个)；500μM(320±53个)；1000μM(100±30个),其中NiCl2500μM和1000μM处理后的迁移细胞相对于未处理组减少(P<0.01)3. STIM1/ORAI1在A549细胞增殖、迁移和侵袭功能中的作用3.1siRNA瞬时沉默A549细胞STIM1/ORAI1基因表达我们应用siRNA沉默A549细胞STIM1基因表达,48h基因瞬时沉默效率最高,可达84%,72h蛋白瞬时沉默效率最高,约70%。我们应用siRNA沉默A549细胞ORAI1基因表达,24h基因瞬时沉默效率最高,可达91%,48h蛋白瞬时沉默效率最高,约80%。3.2A549细胞STIM1/ORAI1基因表达沉默后的SOCE我们在瞬时干扰后72h进行钙功能的测定。相对于Negative干扰组(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,284±52nM), STIM1干扰组出现了SOCE的下降,约1/3(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,194±28nM)(P<0.001)。我们在瞬时干扰后48小时进行钙功能的测定。相对于Negative干扰组(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,145±47nM) ORAI1干扰组出现了SOCE的下降,约1/3(钙内流峰值Δ[Ca2+]i,92±24nM)(P<0.05)。3.3沉默A549细胞STIM1/ORAI1基因表达后的细胞增殖试验我们发现siRNA瞬时沉默STIM1表达后,A549细胞增殖功能没有明显改变。STIM1或ORAI1siRNA干扰后A549细胞24-96h生长曲线和Negative干扰组无差异。3.4沉默A549细胞STIM1/ORAI1基因表达后的细胞迁移和侵袭试验我们发现siRNA瞬时沉默A549细胞STIM1表达后,72h后我们应用Transwell小室法检测细胞迁移率。相对于Negative组(迁移率,38%±2%)STIM1干扰组(迁移率,14%±4%),因此STIM1干扰组的细胞迁移率有下降(P<0.01)。siRNA瞬时沉默A549细胞STIM1表达后,72h后我们应用Transwell小室法检测细胞侵袭。6个视野中,Negative组(迁移细胞,246±23个),STIM1干扰组(迁移细胞,80±11个),因此STIM1干扰组的细胞侵袭实验中迁移细胞有减少(P<0.001)。siRNA瞬时沉默A549细胞ORAll表达后,48h后我们应用Transwell小室法检测细胞迁移率。相对于Negative组(迁移率,30%±12%),ORAI1干扰组(迁移率,12%±5%),与对照组相比ORAIl干扰组的细胞迁移率有下降的趋势,虽然无统计学意义(P=0.084)。siRNA瞬时沉默A549细胞ORAI1表达后,48小时后我们应用Transwell小室法检测细胞侵袭。6个视野中,Negative组(迁移细胞,167±7个),ORAI1干扰组(迁移细胞,71±20个),因此ORAI1干扰组的细胞侵袭实验中迁移细胞有减少(P<0.01)。4.ⅢA期NSCLC患者肿瘤组织STIM1或ORAI1蛋白表达和预后的关系4.1肿瘤组织STIM1或ORAI1表达和患者临床病理特征之间的关系STIM1和ORAI1免疫组化阳性可见在肿瘤细胞胞浆中着色,部分胞膜着色。男性患者中有27例肿瘤组织STIM1低表达(64.3%,P=0.055)；鳞癌患者中有15例STIM1(?)表达(71.4%,P=0.084)；鳞癌患者中有18例ORAI1低表达(85.7%,P=0.067)。4.2STIM1表达和ⅢA期NSCLC患者无疾病复发生存的相关性男性NACLC患者中,STIM1低表达者预后有好于高表达者的趋势(21月vs12月,P=0.06)。鳞癌NSCLC患者中,STIM1低表达者预后有好于高表达者的趋势(33月vs9月,P=0.07)研究结论1.NSCLC肿瘤组织中可测到STIM1和ORAI1mRNA表达,并且腺癌中STIM1基因表达有增高的趋势,低分化肿瘤组织的ORAI1基因表达较高。2.我们实验中发现A549细胞和16HBE细胞中存在着SOCE,并且SOCE部分参与这些细胞的增殖,而SOCE在A549细胞迁移和侵袭中起着重要的作用。3.我们研究发现STIM1/oRAI1介导的SOCE没有参与人肺腺癌A549细胞的增殖,但在体外促进A549腺癌细胞的迁移和侵袭。4.在鳞癌和男性ⅢA期NSCLC患者中,STIM1低表达可能预示着患者有较好的无疾病生存预后。