3D打印多孔β-磷酸三钙掺镧支架用于骨组织修复的体外研究

来源 :福建医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lz251667032
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【目的】由肿瘤,炎症,外伤和手术引起的骨缺损严重影响患者的生活质量。直到今天,自体骨移植仍是治疗骨缺损的金标准。然而,由于供体来源以及免疫排斥的原因,其使用受到了限制,因而骨修复材料领域一直是骨移植治疗的热点。本人利用3D打印技术,并结合钙磷基生物陶瓷和镧元素的生物学效应,构建具备仿生结构的人工骨修复支架,期望赋予其骨诱导性、调控炎症微环境和抑制破骨细胞前体细胞分化的性能,从而具有重要潜力和研究价值,有望成为一种理想的人工骨修复支架。【方法】1.La-β-TCP支架的制备、物理表征、体外模拟降解实验及细胞毒性实验使用固相烧结法及3D打印方式制备x La-β-TCP支架,(x=0,1,3,5,x为La掺入的物质的量百分比,简称La-β-TCP)。对复合材料行X射线衍射(XRD)分析复合材料的物相构成及晶体结构,拉曼光谱分析的化学基团,扫描电镜观察(SEM)材料的表面形貌。材料浸泡于降解液中模拟体外降解,测量降解液中p H值,SEM观察表面结构变化,了解支架矿化能力,MTT实验进行支架细胞毒性检测。2.La-β-TCP支架对骨髓间充质干细胞成骨分化、巨噬细胞极化、破骨细胞分化的影响La-β-TCP支架浸提液与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养,1天和3天后使用CCK-8,活/死染色检测其对BMSCs增值活性的影响;浸提液处理BMSCs 7天和14天后,对成骨标志基因(Runx-2,Col I,OCN)的表达量进行检测;浸提液处理BMSCs 7天,10天后,使用ALP染色,ALP检测实验对成骨标志蛋白碱性磷酸酶表达量进行检测,浸提液处理14天后,使用茜素红染色了解支架浸提液对BMSCs矿化功能的影响;使用La-β-TCP支架浸提液处理RAW264.7细胞系,在第三天采用CCK-8试剂盒检测支架对RAW264.7细胞系增殖活性的影响;支架浸提液处理3天后对炎症相关基因(IL1,CD206,TNF-α,ARG-1)的表达量进行检测,使用ELISA试剂盒检测促炎因子(TNF-α)和抑炎因子(IL-4)的释放,使用流式细胞仪检测其表面抗原(CD86、CD206);支架浸提液对RAW264.7细胞系干预5天后,对破骨细胞表型基因(TRAP)的表达量进行检测,使用抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒对破骨细胞特异性蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)进行检测。【结果】1.利用固相烧结法成功将La引入β-TCP的结构中,均引起相应的晶格膨胀,并应用3D打印技术成功制备孔隙大小基本一致,形态大小均一的La-β-TCP支架(x La-β-TCP,x=0,1,3,5),且该支架体外模拟显示矿化良好,无隐藏毒性。2.通过全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs,在传代至第三代时,显微镜下细胞形态呈长梭形或三角形,集落成鱼群状分布,且流式分析提示细胞纯度较高,成骨、成脂诱导实验提示其具备定向分化能力。3.扫描电镜结果显示BMSCs可以很好地粘附在支架表面。4.利用支架浸提液对BMSCs和RAW264.7细胞进行干预后,CKK-8实验和活/死染色提示其生物相容性良好;ALP检测、ALP染色、茜素红染色以及RT-PCR实验表明La-β-TCP支架具有较好的成骨性能。5.利用支架浸提液对RAW264.7细胞进行干预后,RT-PCR、ELISA和流式细胞仪检测显示,随着La的掺入,La-β-TCP支架具备抑制RAW264.7细胞向M1表型极化,并促进其向M2表型同时抑制其释放炎症因子TNF-α的生物学性能。6.利用支架浸提液对RAW264.7细胞进行干预后,RT-PCR和TRAP检测实验提示掺La的β-TCP支架具备调控巨噬细胞向破骨细胞分化的能力。【结论】利用3D打印技术结合固相烧结法成功制备La-β-TCP支架(x La-β-TCP,x=0,1,3,5),该支架生物相容性良好,不仅具有较高的诱导大鼠BMSCs成骨分化能力,且其具备一定的抑制炎症和抑制破骨细胞生成的作用。
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