白旗兜兰(Paphiopedilum spicerianum)是我国极小种群物种,具有极高的观赏价值和科研价值,是兰科植物保护中的明星物种。在我国境内,仅发现一个生长在云南省普洱市思茅区一个外来移民村的村入口小河边陡坡上的残存种群。在野外建立能够自我维持的种群,被认为是有效地保护白旗兜兰的主要策略。本研究在白旗兜兰保护实践的基础之上,调查总结白旗兜兰非共生萌发植株在回归、人工辅助移植后的生长、繁殖状况。通过迁地共生萌发技术分离得到白旗兜兰有效共生萌发真菌,利用分离到的有效共生萌发真菌开展白旗兜兰种子的共生萌发研究,并尝试将真菌种子袋直接应用于人工辅助移植的保护实践中,以期实现对白旗兜兰的有效保护。1.白旗兜兰非共生萌发苗在回归、人工辅助移植地存活状况本研究对白旗兜兰非共生萌发苗回归、移植后的植株生长状况进行分析评估,发现植株在回归、辅助移植的前两年存活率都较高;但在第二年到第三年之间,植株存活率快速减少。白旗兜兰非共生萌发苗在回归地、辅助移植地经过一定时间的生长后都能开花,回归地存活植株能自然结实,辅助移植地存活植株开花后能否结实仍然需要进一步的观察。2.白旗兜兰内生真菌的分离(1)通过放置种子袋的方法开展就地共生萌发,经过6个月的连续观察均未能获得共生萌发形成的原球茎或幼苗。迁地共生萌发中,种子在雨季取的土壤基质上能形成共生萌发的原球茎;而在旱季土壤基质上种子未能萌发,其主要原因可能与取样时间有关。(2)利用迁地共生萌发技术,成功获得白旗兜兰种子共生萌发形成的原球茎,并从中成功分离得到2株内生真菌GYBQ01、GYBQ02。经分子鉴定所得菌株均为胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌,其相关序列已被上传至GenBank,编号分别为MN733451、MN793984。MN733451与序列号为JX514385.1的胶膜菌最为相似,最大相似度为99.84%;MN793984与序列号为JX545225.1真菌最为相似,最大相似度为99.64%。3.分离真菌对种子萌发的促萌发效果和特异性(1)通过白旗兜兰种子在燕麦培养基(OMA)上的接菌萌发实验,结果表明,分离到的2株真菌均能有效促进白旗兜兰种子萌发直到幼苗阶段,空白对照组未形成原球茎;种子接GYBQ01菌株培养60 d后种子萌发率、原球茎形成率分别为78.93±1.02%、22.86±2.91%;种子接GYBQ02菌株培养60d后种子萌发率、原球茎形成率分别为78.93±1.02%、35.83±2.96%;种子接GYBQ01、GYBQ02菌株培养90d后有大量幼苗形成,幼苗形成率分别为30.83±2.56%、43.45±3.16%。相比较而言,白旗兜兰种子接GYBQ02菌株培养120 d后的幼苗形成率更高,达57.62±3.58%,而接GYBQ01菌株的幼苗形成率为38.45±2.93%。(2)用竹叶兰的有效共生萌发真菌Tulasnella sp.2与白旗兜兰种子共培养,120 d后,种子未形成原球茎。带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)种子接菌萌发实验中,60 d后,接GYBQ01菌株的处理能形成原球茎段,但不能向幼苗阶段成功转变;其他接菌处理未形成原球茎。从这些结果可知,白旗兜兰和带叶兜兰种子萌发阶段对菌根真菌的选择具有一定的特异性。4.白旗兜兰有效共生萌发真菌直接用于保护实践的初步探究利用分离到的有效促萌发真菌制成真菌种子袋,分别放置在原生地灭菌基质和人工辅助移植地。经过120 d的培养观察,结果表明,实验室原生地灭菌基质上的种子袋可以萌发形成幼苗,且生长良好,理论上证明真菌种子袋可以直接用于白旗兜兰的保护实践中。5.利用分离到的有效促萌发真菌培育白旗兜兰共生萌发苗播种在燕麦培养基的种子与有效共生萌发真菌共培养120 d,得到长有叶、根的幼苗,将幼苗移植到白旗兜兰原生地基质上实验室内继续培育,成功得到了一批白旗兜兰的共生萌发植株,可用于白旗兜兰的野外回归。