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第一部分生物信息学分析结直肠癌患者组织中整合素α6/β4的分布情况目的:通过生物信息学分析整合素α6（Integrinα6,ITGA6）及整合素β4（Integrinβ4,ITGB4）在结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）组织及正常组织中的分布情况。材料与方法:本研究第一部分将（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中结肠癌和直肠癌数据与其配对的癌旁正常组织中ITGA6及ITGB4相关数据与（The Genotype-Tissue Expression,GTEx）数据库中正常结肠组织中进行比较,并分析ITGA6与ITGB4表达与CRC临床特征之间的关系。通过在线starbase Pancancer工具和GEPIA网站对ITGA6与ITGB4进行基于基因表达水平的生存分析。对靶基因进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,筛选二者的共同通路。通过STRING网站分析ITGA6与ITGB4的蛋白互作网络（protein protein interaction network,PPI network）。结果:生物信息学分析结果提示ITGA6和ITGB4在结直肠癌组织中的表达均显著高于正常结肠组织（P<0.05;P<0.05）。ITGA6在结直肠癌肿瘤不同分期的组织中表达有差异:Ⅳ期结直肠癌组织中ITGA6基因的表达量显著下降（P0.05）。ITGA6与ITGB4的基因表达在结直肠癌组织中呈现显著的相关性（R=0.64,P<0.001）。对ITGA6与ITGB4的共表达基因进行KEGG通路分析中发现,两者相关基因主要集中在ECM-receptor interaction通路。ITGA6高表达CRC患者的总体生存率显著高于ITGA6低表达患者,二者间的差异具有统计学意义（HR=0.60,P0.05）。结论:ITGA6与ITGB4在结直肠癌患者肿瘤组织中高表达,其中ITGA6与结直肠癌的疾病进展密切相关。第二部分结直肠癌细胞外泌体的分离提取与鉴定目的:为探索结直肠癌细胞外泌体在肿瘤转移中的机制,本研究第二部分对结直肠癌细胞外泌体进行分离提取与鉴定。材料与方法:培养高转移潜能结直肠癌细胞系（SW620/HCT116）和低转移潜能结直肠癌细胞系（SW480/Caco2）并收集细胞培养上清液。采用超速离心法获取结直肠癌细胞相关外泌体。通过蛋白免疫印迹（Western blot,WB）鉴定外泌体蛋白标志分子（CD9,CD63和TSG101）;透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察外泌体大小及形态;纳米颗粒跟踪分析仪（Nanoparticle tracking analyzer,NTA）检测外泌体颗粒浓度和粒径分布。结果:WB结果显示,采用超速离心法分离法获取的四株结直肠癌细胞培养上清液中的囊泡表面均表达外泌体标志分子CD9,CD63和TSG101。NTA分析四株结直肠癌细胞分泌的囊泡大小显示:其大小分布在100nm左右。TEM观察分离纯化的四株结直肠癌细胞分泌的囊泡形态,结果提示囊泡呈盘状,为双层膜性囊泡结构,符合外泌体的形态特征。结论:采用超速离心法分离和纯化方法可以获得来源于体外培养的结直肠癌细胞培养上清液中的外泌体,其具有典型的外泌体生物学特征。第三部分肿瘤相关外泌体整合素α6/β4促进血管内皮细胞增殖及小管形成目的:本研究第三部分拟通过体外实验探索结直肠癌细胞外泌体ITGA6与ITGB4在肿瘤侵袭过程中的作用,为进一步研究结直肠癌转移亲器官性的相关分子机制奠定基础。材料与方法:WB检测高转移潜能结直肠癌细胞系（SW620/HCT116）和低转移潜能结直肠癌细胞系（SW480/Caco2）中ITGA6与ITGB4的表达水平。酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测HCT116/SW620与SW480/Caco2细胞培养上清液中ITGA6和ITGB4的蛋白水平。在SW620和HCT116细胞系中通过合成ITGA6与ITGB4的sh RNA质粒载体,慢病毒包装感染构建稳定低表达的细胞系。将敲除ITGA6与ITGB4的SW620、HCT116及其对照组细胞系的外泌体与血管内皮细胞共培养,CCK8法检测外泌体对细胞增殖能力的影响;小管形成实验检测外泌体对血管形成能力的影响。在SW480和Caco2中构建稳定过表达ITGA6与ITGB4的细胞系。将过表达ITGA6与ITGB4的SW480、Caco2及其对照组细胞系的外泌体与血管内皮细胞共培养,CCK8法检测外泌体对细胞增殖能力的影响;小管形成实验检测外泌体对血管形成能力的影响。结果:高转移潜能细胞系SW620/HCT116中ITGA6和ITGB4的m RNA表达量较低转移潜能细胞系SW480/Caco2显著上调（P<0.01;P<0.01）。ITGA6和ITGB4在SW620/HCT116细胞培养上清液中表达显著高于SW480/Caco2（P<0.01;P<0.01）。WB结果显示,SW620/HCT116细胞外泌体中的ITGA6和ITGB4表达水平显著高于SW480/Caco2细胞。与SW480/Caco2细胞外泌体相比,SW620/HCT116细胞外泌体显著促进血管内皮细胞的增殖。与SW480/Caco2来源的外泌体相比,HCT116/SW620细胞外泌体与血管内皮细胞共培养显著增加其小管形成能力（P<0.05;P<0.05）。敲除ITGA6和ITGB4后,SW620/HCT116细胞外泌体促进血管内皮细胞增殖及小管形成能力均显著降低（P<0.05;P<0.05）。过表达ITGA6和ITGA4后,SW480/Caco2外泌体促进血管内皮细胞的增殖及小管形成能力均显著增强（P<0.01;P<0.05）。结论:结直肠癌细胞外泌体ITGA6和ITGB4能够显著促进血管内皮细胞的增殖及小管形成。第四部分肿瘤相关外泌体整合素α6/β4促进结直肠癌肺转移目的:本研究第四部分通过体内实验探索结直肠癌细胞外泌体ITGA6与ITGB4在肿瘤转移亲器官性的相关分子机制,为结直肠癌转移相关研究提供更有效的预防和治疗靶点。材料与方法:运用经荧光素酶标记的慢病毒转染低转移潜能细胞SW480,将其经裸鼠尾静脉注射并建立肺转移动物模型。提取高转移潜能细胞SW620/HCT116外泌体,经裸鼠尾静脉注射,接种1月后采用活体成像观察外泌体对裸鼠肺转移病灶的影响。运用经荧光素酶标记的慢病毒感染高转移倾向细胞SW620,将其经裸鼠尾静脉注射并建立肺转移动物模型。运用外泌体分泌特异性抑制剂GW4869处理裸鼠2周。接种1月后活体成像观察抑制剂对裸鼠肺转移病灶的影响。运用经荧光素酶标记的慢病毒转染低转移潜能细胞SW480,将其经裸鼠尾静脉注射并建立肺转移动物模型。将敲除ITGA6/ITGB4的SW620/HCT116细胞及其对照组细胞外泌体处理裸鼠。接种1月后采用活体成像观察外泌体对裸鼠肺转移病灶的影响。结果:单独注射SW480细胞的小鼠没有发生明显的肺转移,但有转移灶出现在腹腔内。注射SW480细胞及SW620细胞来源外泌体的小鼠可显著增加SW480细胞引起的肺脏转移;而注射SW480细胞及HCT116来源外泌体的小鼠未发现存在增加肺转移情况,但存在其他部位的转移。使用外泌体生成/释放的抑制剂GW4869处理后,显著抑制了结直肠癌细胞SW620向肺部的转移（P<0.05）。与对照组相比,敲除ITGA6和ITGB4后的SW620细胞外泌体显著减少了小鼠肺转移病灶的比例（P0.05）。结论:结直肠癌细胞来源外泌体可通过其表面整合素蛋白ITGA6和ITGB4诱导结直肠癌向肺脏发生定向转移。