【摘 要】
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实验目的:提取分离纯化短管兔耳草多糖,解析其结构,并探究其抗肿瘤活性,建立多糖结构与其抗肿瘤活性的构效关系,并初步探讨其作用机制。实验方法:（1）采用水提醇沉的方法得到粗多糖,并通过DEAE-纤维素分离纯化得到2个部位LBMP-1和LBMP-2。（2）测定LBMP-2化学成分,分子量,单糖组成,通过红外光谱、核磁共振、原子力显微镜、扫描电镜、透射电镜分析LBMP-2结构。（3）通过DPPH,ABT
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实验目的:提取分离纯化短管兔耳草多糖,解析其结构,并探究其抗肿瘤活性,建立多糖结构与其抗肿瘤活性的构效关系,并初步探讨其作用机制。实验方法:（1）采用水提醇沉的方法得到粗多糖,并通过DEAE-纤维素分离纯化得到2个部位LBMP-1和LBMP-2。（2）测定LBMP-2化学成分,分子量,单糖组成,通过红外光谱、核磁共振、原子力显微镜、扫描电镜、透射电镜分析LBMP-2结构。（3）通过DPPH,ABTS,还原性实验测定LBMP-2的体外抗氧化活性。（4）通过MTT法测定LBMP-2对B16-F10细胞增殖的影响,通过细胞能量代谢仪Seahorse测定LBMP-2对B16-F10细胞能量代谢的影响。（5）建立动物荷瘤模型:将细胞密度为4×10~5个/mL的B16-F10细胞悬液皮下注射0.1 mL到小鼠左前肢背部,随机分组4天后腹腔注射CTX（20 mg/kg）,NS（10 mL/kg）,高剂量LBMP-2（30 mg/kg）,低剂量LBMP-2（15 mg/kg）,连续注射11天后,在第12天取材。HE染色检测瘤体和脾的组织病理变化,免疫组化检测黑色素瘤中AMPK的表达水平、脾CD3+、CD4+、CD8+的表达水平。实验结果:（1）经过化学成分检测,分离纯化得到LBMP-2不含多酚和蛋白质,其得率为1.62±0.43%,其中总糖含量为18.95±1.3%,糖醛酸含量为67.6±0.32%。（2）HPGPC法测得LBMP-2的分子量为23.799kDa,Mw/Mn=1。表明LBMP-2是分子量均一体系多糖。IC法确定LBMP-2由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸组成,其摩尔比为0.156:0.144:0.107:0.114:0.480。IR法和NMR法确定LBMP-2是α-吡喃糖苷构型。AFM结果显示LBMP-2有一个支链,其主链长度约为398nm,宽度约为15nm,最高处为224pm,支链长度约为70nm。SEM结果显示LBMP-2是松多孔的片状结构,且拥有高支化结构。TEM结果则提示LBMP-2在水溶液中容易聚集可能与多糖链的自组装过程有关。（3）体外抗氧化结果显示LBPM-2在体外有良好抗氧化活性。（4）MTT法结果显示LBPM-2在体外抑制B16-F10细胞的增殖,Seahorse结果显示LBPM-2在体外抑制B16-F10细胞的能量代谢。（5）动物荷瘤实验结果表明LBPM-2可抑制体内肿瘤的生长,升高脾指数,下调黑色素瘤中AMPK蛋白的表达,下调脾中CD4+,CD8+的表达,上调CD3+的表达。实验结论:短管兔耳草成功分离出两个部位多糖LBMP-1和LBMP-2。LBPM-2是一个分子量为23.8 kDa的均一体系多糖,属于α-吡喃糖苷构型,由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸5种单糖构成,半乳糖醛酸是其主要单糖。LBPM-2在体外有良好的抗氧化活性和抗B16-F10细胞增殖活性。LBPM-2在体内可抑制黑色素瘤的生长,其机制可能是通过调节免疫功能,同时下调黑色素瘤中AMPK的表达,抑制肿瘤细胞能量代谢。这些药理活性可能与单糖组成和空间结构有关。
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