1.研究目的1.MR体素内不相干运动模型（intravoxel incoherent motion,IVIM）监测兔肝VX2瘤在3个不同感兴趣区及4周内各参数的变化。2.探讨MR弥散加权多参数成像定量分析模型,包括体素内不相干运动模型（IVIM）、弥散峰度模型（diffusion kurtosis imaging,DKI）以及拉伸指数模型（stretched-exponential model,SEM）监测兔肝VX2瘤在不同时间点各参数的变化。同时比较灌注相关参数与肿瘤内微血管密度的相关性。2.研究方法此研究通过了动物委员会的伦理审查。2.1实验兔的制备首先将VX2肿瘤株植入到荷瘤兔后肢大腿肌肉内,约2周左右待肿瘤直径超过lcm为制备成功移植备用。选取18只（雄性=11和雌性=7）健康成年新西兰白兔,体重位于2.5和3.5公斤之间,禁食不禁水8小时。麻醉采用盐酸赛拉嗪注射液（速眠新II,吉林,中国）,2 mg/kg皮下注射,维持麻醉采用3%戊巴比妥钠,30 mg/kg耳缘静脉注射。麻醉后将兔固定于手术台,荷瘤兔大腿肿瘤最隆起处备皮,碘伏消毒,眼科剪剪开皮肤及肿瘤被膜,选取肿瘤周边血供丰富的活瘤组织,剪成1mm3瘤块,放入生理盐水中备用;实验兔常规腹部备皮,以剑突为中心碘伏纱布消毒,剑突下腹中线皮下切口,血管钳逐层钝性分离腹部肌肉,直至暴露出肝脏。选取肝左叶中部,采用眼科镊制备约5mm隧道,将瘤块通过隧道轻轻推入肝实质,后用明胶海绵封闭。所有瘤块均成功植入18只实验兔肝脏。所有实验兔于肿瘤植入后12-14天行MR扫描。2.2 MR信号采集所有的的实验兔于扫描前禁食不禁水4-6小时。采用1.5-T MR图像采集系统（Achieva 1.5 T,Philips Healthcare,Best,Netherlands）,专用动物线圈,仰卧位,扫描前半小时先后皮下注射2 mg/kg盐酸赛拉嗪注射液（速眠新II,吉林,中国）及耳缘静脉注射30 mg/kg 3%戊巴比妥钠麻醉。扫描常规获得定位图、横断位T2-加权快速自旋回波（重复时间/回波时间,2100/100 msec;层厚,2.5 mm;矩阵,148 × 115）以及T1-加权梯度回波序列（重复时间/回波时间,410/10msec;层厚,2.5mm;矩阵,148×120）。接着采集MR弥散加权IVIM序列:采用自由呼吸单次激发平面回波序列,使用在三个正交方向下施加扩散梯度。参数为重复时间/回波时间,TR/TE,～1310/65 msec;层厚,3 mm;扫描野,10 ×10cm2;矩阵,68×64;激励次数,6;分别选取2组b值:第一组12b值（b=0,10,20,30,40,50,75,100,150,300,500,and 800 s/mm2）,用于 ADC and IVIM模型分析;第二组 6b 值（b=0,400,800,1200,1600,and2000 s/mm2）用于 DKI及SEM模型分析（见图1）。2.3图像后处理DWI采集的数据传输至工作站,采用Philips公司自带的图像处理软件（PRIDE DWI Tool,version 1.5,Philips Healthcare）以及工作站（Extended Workspace,Philips Healthcare）生成各参数图,借助美国国立卫生院研发的Image J软件提取并测定ADC值及其他非高斯分布模型参数值,包括分子弥散系数（true diffusion coefficient D）、假弥散系数（pseudodiffusion coefficient,D*）、灌注分数（the perfusion fraction,f）、弥散系数（the diffusion coefficient,DDKI）,扩散峰度（diffusional kurtosis,KDKI）,分布扩散系数（the distributed diffusion coefficient,DSEM）以及拉伸指数（the stretching parameter,αSEM）。ADCs值采用单指数拟合,所有b值计算得出。IVIM参数值通过使用基于以下方程的非线性双指数拟合[29]连续计算得出:SI/SI0=(1-力· exp（-bD）+f· exp（-bD*）,其中SI代表有弥散加权因子b时的信号强度,SI0为b值=0时ROI的平均信号强度,SI为高b值的信号强度。其他尚包含分子弥散参数系数D,以及毛细血管灌注相关参数,假扩散系数D*及灌注分数f。DKI及SEM模型的计算公式分别为:SI = SI0 ·exp（-b·DDKI + b2·DDKI 2 KDKI/6）[12],及 SI =SI0 ·exp-（b·DSEM）αSEM[13]。其中DDKI代表弥散系数,KDKI为扩散峰度,DSEM为分布扩散系数,αSEM为拉伸指数。利用Image J软件分别在病灶内做感兴趣区（FOV）,ROI分别选取整个病灶最大层面、肿瘤内弥散最受限区以及病灶周边。分别测量肿瘤2周、3周及4周3个不同的时间点的ADC值、D值、D*值以及f值,比较各参数在不同ROI及时间点的差异。统计学分析采用SPSS V20.0软件。每个动物的 ADC、D、D*、f、DDkI,、KDKI,、DSEM,以及 αSEM 个参数图分别在逐层像素的基础上创建（见图1）。2.4 ROI的选取2位放射诊断医师（吴海军及胡茂清,分别为7年及16年的肝脏MRI诊断经验）分别回顾分析所有实验兔的MR检查图像。利用 Image J 软件（National institute of Health,Bethesda,MD）分别在病灶内做感兴趣区（ROI）,ROI手工绘制,选取包含肿瘤最大直径的层面,在ADC图上手动画取整个病灶、肿瘤内弥散最受限区（MRDA）以及病灶周边3个感兴趣区（图1）,后将3个ROI分别拷贝至D图,D*图,及f图。常规T2WI作为对应的ADC及IVIM参数图的解剖对照图（图2）。分别测量肿瘤2周、3周及4周3个不同的时间点的ADC值、D值、D*值以及f值,每组数据重复测量3次取均值,比较各参数在不同ROI及时间点的差异。统计学分析采用SPSS V20.0软件。对于数据分析,PRIDE软件将会计算拟合优度（Goodness of fit）,R2,一个合适的拟合优度R2应>0.8,若R2<0.8,则本研究将会舍弃该数据,不参与统计分析。由2位放射诊断医师（吴海军及胡茂清,分别为7年及16年的肝脏MRI诊断经验）分别回顾分析所有实验兔的MR检查图像。分别测量各参数,分析比较各值的一致性。利用 Image J 软件（National institute of Health,Bethesda MD）在病灶内做感兴趣区（ROI）,ROI手工绘制,选取包含肿瘤最大直径的层面,在ADC图（b=150s/mm2）上手动画取整个病灶,后将ROI分别拷贝至D图、D*图、f图、DDKI图、KDKI图、DSEM图以及αSEM图。分别测量肿瘤2周、3周及4周3个不同的时间点的ADC值、D值、D*值、f值、DDK1值、KDKI值、DSEM值以及αSEM值,每组数据重复测量3次取均值,比较各参数在不同时间点的差异。统计学分析采用SPSSV20.0软件。对于数据分析,PRIDE软件将会计算拟合优度（Goodness of fit）,R2,一个合适的拟合优度R2应>0.8,若R2<0.8,则本研究将会舍弃该数据,不参与统计分析。2.5组织学评估所有18个动物在磁共振成像后实施安乐死。安乐死后,将肝脏进行收获尸检。肝脏标本固定在10%缓冲的甲醛溶液,组织切片同MR层厚（3毫米）,通过肿瘤的最大截面,并包埋在石蜡中用于组织学检查。组织学切片用苏木精-伊红（H-E）染色。所有组织学实验标本均咨询病理学专家,确定肿瘤细胞密集区,稀疏区和坏死区。组织学切片同时行特定的内皮抗原CD34免疫组织化学染色（单克隆小鼠抗体抗CD34,DAKO,丹麦）来计数肿瘤的平均血管密度（MVD）。首先,将各载玻片在低倍率（×40）成像,以确定热点（其中MVD值最高）,然后在高放大倍率（×200）分别取3个视野计数微血管,以染成棕色的血管内皮或内皮细胞束作为1条血管数,血管腔和腔内的红细胞不作为计数单位,与抗体起反应的巨噬细胞和浆细胞等在镜下根据形态学差异予以排除,以3个高倍镜视野的微血管平均数作为该切片的MVD值。数字化光学放大图像采集系统（尼康,日本）拍照（见图3）。所有组织学实验标本均咨询病理学专家。2.6统计学分析利用SPSS V20.0软件（SPSS,Chicago,Il1）及Medcalc软件进行统计学分析,P<0.05具有统计学意义。2.6.1参数可重复性比较2.6.1.1 ADC和IVIM参数的重复性分析计算组内相关系数(Intraclass Correlation Coefficient,ICC对两位医师测量值进行一致性检验。随机选择10只兔,选用肿瘤周边区域的任意时间点测量数据进行评估ADC和IVIM各参数的可重复性。2位放射诊断医师各自测量的数据计算得出ICC。2.6.1.2 DW-MRI各参数的可重复性分析计算组内相关系数（Intraclass Correlation Coefficient,ICC）及 Bland-Altman对两位医师测量值进行一致性检验。选取第3周所有18只模型兔测量的选8个参数,重复测量以评估各参数的可重复性。2位放射诊断医师各自测量的数据计算得出组内相关系数（The intraclass correlation coefficient,ICC）进行一致性检验。同时也采用Bland-Altman方法来评估各组测量值的可重复性。比较第1和第2次DW成像测量值的平均绝对差（偏差）以及95%置信区间的平均差（一致性范围,limits of agreement,LOAs）。2.6.2 ADC和IVIM参数在不同ROI测量值的比较对于肿瘤的不同的ROI,ADC及IVIM各参数在不同的时间点的差异使用Friedman检验进行比较。在具有统计意义的情况下,进一步的比较采用Wilcoxon符号秩检验。此外,比较各时间点肿瘤3个不同感兴趣区ADC和IVIM各参数的差异,采用Kruskal-Wallis检验或Mann-Whitney检验,P<0.05具有统计学意义。2.6.3在每个时间点肿瘤内3个感兴趣区ADC和IVIM参数的比较对于肿瘤的不同的ROI,ADC及IVIM各参数在不同的时间点的差异使用Friedman检验进行比较。在具有统计意义的情况下,进一步的比较采用Wilcoxon符号秩检验。此外,比较各时间点肿瘤3个不同感兴趣区ADC和IVIM各参数的差异,采用Kruskal-Wallis检验或Mann-Whitney检验,P<0.05具有统计学意义。2.6.4 DW-MRI各模型参数的比较应用Friedman检验比较8个参数在3个不同时间点变化。在统计意义的情况下,进一步的比较使用Wilcoxon符号秩检验。此外,使用Kruskal-Wallis检验或Mann-Whitney检验比较确定弥散相关的参数ADC值、D值、DDKI值、以及DSEM值在任意时间点是否存在差异。2.6.5 DW-MRI灌注相关参数与MVD的相关性分析采用单变量线性回归分析比较相关参数ADC值、f值和D*值预测肿瘤内血管数量的能力,第2周至第4周的ADC值、f值和D*值作为自变量,肿瘤内MVD作为应变量。应用多元线性回归模型确定这些变量的线性组合能否提高MVD的预测。在此分析中仅仅在单变量分析显示高度相关性的变量才会被纳入多变量分析,采用以下线性模型:MVD= 0 +β1 ADC +β2f+β3 D*在方程式的β为估计回归系数。对于每个回归分析需要计算相关系数r2。3.研究结果3.1可重复性分析3.1.1 ADC和IVIM参数的重复性在10只兔的进行MR数据的重复测量,ADC值、D值和f值呈现良好的可重复性,ICC 分别为 0.978（95%CI:0.912-0.995）,0.964（95%CI:0.854-0.991）和0.920（95%CI:0.679-0.980）。D*表现出相对好的可重复性,ICC为0.797（95%CI:0.184-0.950）。3.1.2 DW-MRI各参数的可重复性分析选取第3周所有18只模型兔的8个参数进行MR重复测量,ICC的范围为0.745至0.967（见表1）。重复测量的Bland-Altman分析见图2所示。ADC值、D值、f值、DSEM值、以及DDKI值均表现出良好的可重复性。而f*值、αSEM值以及KDKI值则相对好的可重复性。D值的ICC（0.967,95%CI:0.865-0.993）在本组参数中最高,而 KDKI的ICC（0.745,95%CI:0.160-0.872）最低。3.2参数测量3.2.1 ADC和IVIM参数在不同ROI的连续变化Friedman检验及Kruskal-Wallis检验用于比较不同ROI的ADC及IVIM各参数的变化,结果显示虽然所有ROI的ADC值及D值（在括号范围为中位数）从第2周至第4周的测量值逐渐减少,但仅有整个病灶的ADC值、肿瘤内MRDA的ADC值及MRDA的D值在不同的时间点之间的测量值具有显著差异（p值分别为 p= 0.000,p = 0.024 和 p=0.001）。Wilcoxon符号秩检验进行进一步的比较显示:第4周整个病灶的ADC值显著低于第2周及第3周的测量值,p值分别为f=0.000及p= 0.014;第4周肿瘤内MRDA的D值显著低于第2周及第3周的测量值,p值分别为p = 0.014及p= 0.012。然而,第2周及第3周整个病灶的ADC值与MRDA的D值无统计学差异。就肿瘤内MRDA的ADC值而言,第2周与第4周有统计学差异（p = 0.011）,而第3周与第2周、第3周与第4周无统计学差异。第2周至第4周所有3个ROI的f值逐渐下降并具有统计学差异。与第2周比较,第3周整个病灶、肿瘤内MRDA及病灶肿瘤周边的f值显著下降（尽管没有统计学差异）,第4周持续下降且有统计学差异（整个病灶、MRDA及病灶肿瘤周边的p值分别为p=0.004,p = 0.002,andp = 0.018）。此外,第3周与第4周上述3个ROI的f值的比较有统计学差异（p值分别为p=0.001,p= 0.000,andp= 0.000）。然而,第2周至第4周所有3个ROI的D*值均无有统计学差异。3.2.2在每个时间点肿瘤内3个感兴趣区ADC和IVIM参数的变化Kruskal-Wallis检验表明第2周、第3周及第4周3个时间点,整个病灶、MRDA和肿瘤周边区域的ADC值、D值和f值具有统计学差异。然而,第2周、第3周及第4周3个时间点,整个病灶、肿瘤内MRDA和肿瘤周边区域的D*值均无统计学差异。Kruskal-Wallis检验进一步比较显示第2周、第3周及第4周3个时间点,整个病灶与MRDA、MRDA与肿瘤周边区域的ADC值、D值和f值具有统计学差异。Mann-Whitney检验比较显示上述3个时间点整个病灶与肿瘤周边区域的ADC值、D值和f值均无统计学差异。3.2.3 DW-MRI各模型参数的连续变化第2周至第4周的ADC值、f值以及KDKI值的变化具有统计学意义（p值分别为p= 0.000,P = 0.000和p = 0.002）。虽然第2周至第4周的ADC的逐渐下降,然而f值以及KDKI值表现出了先升后降的变化。进一步的比较表明,第2周和第4周的ADC值、f值以及KDKI值（p值分别为p=0.000,p = 0.004,和p= 0.017）以及第3周和第4周的ADC值、f值以及KDKI值（p值分别为p=0.014,p = 0.001,和p = 0.012）均具有统计学差异。但是,第2周和3周比较,所有3个参数均无统计学差异（p值分别为P = 0.102,P = 0.500和p = 0.064）。此外,第2周至第4周的D值、D*值、DDKI值、DSEM值以及αSEM值的连续测量出无统计学差异。3.2.4弥散相关的参数的比较和P值第2周至第4周的时间范围内,ADC值与D值、ADC值与DDKI值、D值与DDKI值、D值与DSEM值之间均有显著差异（p值分别为P = 0.002,P = 0.001,p = 0.000和p = 0.006）。然而,ADC值与DSEM值、DDKI值与DSEM值在各时间点均无统计学差异（P值分别为P = 0.317和p = 0.254）。3.2.5灌注相关参数与MVD的相关性分析MVD作为自变量与灌注相关的参数进行单因素线性回归分析。ADC值、f值以及D*值同MVD的相关系数r2见表4。第4周的ADC值与f值与MVD具有高度相关性（分别为r2=0.307,p=0.017和r2=0.402,p<0.01,）。然而任何时间点D*值与MVD均无具有统计学意义的相关性。同时将第4周的ADC值、f值以及D*值作为预测变量,,MVD作为应变量进行多元线性回归分析（见表5）。分析显示仅f值（p = 0.001）和ADC值（p = 0.002）的回归系数的估计具有统计学意义。3.3组织学评估实验兔于最后一次磁共振成像后的一个小时内处死,大体标本显示第3周移植肿瘤的中心开始出现小的坏死灶,HE切片显示肿瘤的外围为簇状分布的肿瘤细胞密集区、接近粘液变性的细胞稀疏区及散在分布的细胞坏死区。4.结论1.肝癌动物模型IVIM成像,肿瘤内感兴趣区设置会影响ADC值、D值和f值测量,D*值不受影响。由于肿瘤内弥散最受限区（MRDA）测量的ADC值,D值和f值均小于在包括整个肿瘤或肿瘤周边区域测量的相应值,如果将ROI选择放置在肿瘤内弥散最受限区（MRDA）,肿瘤治疗反应的评价将会受到影响。ROI选择设置在整个肿瘤或肿瘤的周边区在2-4周的时间点之间没有统计学差异,因此,IVIM成像评估肿瘤的研究,推荐将ROI设置包括整个肿瘤或肿瘤周边区,不推荐将ROI设置在肿瘤内弥散最受限区（MRDA）。2.在所有的ADC值以及IVIM参数中,D*值在所有3个感兴趣区及3个时间点均无统计学差异。因此,在IVIM评估肝肿瘤的疗效研究中,观察D*值的变化似乎最为客观,但同时应当考虑到D*值的可重复性较差。3.VX2瘤移植后2-4周的治疗时间窗内,2周和3周肝VX2瘤所有3个不同ROI的ADC值、D值和f值均无统计学显著差异,因此肿瘤移植后第2周至第3周应被视为IVIM DWI影像监测肝VX2瘤的演化与疗效评估最为客观的观察时间。4.借助DW-MPI监测肝VX2瘤,在肿瘤种植后2、3、4周的治疗时间窗内,D、D*、DDkI、DSEM及αSEM在各时间点的变化均无统计学差异,推荐作为监测肝VX2瘤的演化与疗效评估较为客观的参数;而ADC值、f值和KDKI值具有统计学差异,相对缺乏客观性。5.评估灌注相关参数ADC、D*、f与肿瘤组织微血管密度（MVD）的相关性,结果显示第4周的ADC值与f值与MVD具有高度相关性,D*值与MVD均无相关性。提示肿瘤移植后第4周的ADC值与f值可以用于评估肿瘤治疗前后微血管变化的指标。