Cks1b,又称细胞周期依赖蛋白酶调节亚基（cyclin-dependent kinases regulatory subunit 1）,是由人类染色体1q21区的CKS1基因编码的一类小分子蛋白（9kDa）。它在功能上高度保守,在人类、青蛙、果蝇、酵母等多种生物体内的细胞周期调节方面,发挥必不可少的作用。在细胞体内,Cks1b可以和SCF/SKP2复合物特异性结合,通过改变SCF/SKP2复合物的结构域,来促使CDK（cyclin-dependent kinases）抑制剂p21、p27等蛋白的泛素化。泛素化的p21和p27可以被26S蛋白酶所识别并被降解,从而活化CDK的功能。活化的CDK可以通过Cdk2/CyclinE、Cdk2/CyclinA等途径来调节细胞由G1期向S期的转化。迄今已发现的,CKS1B参与调解的SCF/SKP2催化的底物有:p27、p21、CDT-1、p130、p57 等。近年来,很多国内外的学者发现,Cks1b的表达与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关,如在非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌的患者病理切片中均发现,Cks1b、SKP2、p27的表达有一定的相关性,且Cks1b蛋白这些肿瘤中的表达水平增高。Slotky等在乳腺癌中发现,Cks1b的表达与肿瘤的恶性程度、年龄、雌激素和孕激素受体表达水平都有一定的相关性,且Cks1b的表达随着肿瘤恶性程度的增高而增高。我们在以前的的研究中也发现,在多发性骨髓瘤病人标本里,1号染色体1q21区连锁扩增与高危型多发性骨髓瘤的预后密切相关,Cks1b定位于这一染色体区,且它的表达水平与1q21区连锁扩增的拷贝数呈正相关,与多发性骨髓瘤病人的预后呈负相关。Cks1b的高表达被认为是多发性骨髓瘤预后不良的一个指标,而在多发性骨髓瘤的细胞系中,过表达Cks1b可以促进肿瘤细胞的增殖和抗凋亡。多发性骨髓瘤,是一种浆细胞恶性肿瘤,贫血、感染、出血、骨痛、蛋白尿、高凝状态和静脉血栓等是其常见的并发症。针对多发性骨髓瘤的治疗方式主要有:化学治疗、免疫治疗和造血干细胞移植。而化学治疗是多发性骨髓瘤的主要治疗方式,常用的传统化疗药物有:长春新碱、阿霉素、地塞米松、卡氮芥、环磷酰胺、马法兰等。而近年来,很多新的靶向治疗药物及方案被应用到骨髓的治疗中,如反应停（沙利度胺）、雷利度安、和蛋白酶体抑制剂等。耐药是肿瘤化学治疗的最主要困难之一。一些化疗药物在长期的应用过程使肿瘤对未接触过的、结构不同、机制各异的多种抗肿瘤药物同时具有了交叉耐药性。这种多药耐药主要是通过上调ATP结合转运蛋白（ATP-binding cassette transporters）超家族的成员,能量依赖性的将药物泵出细胞外,减少药物转运入细胞,从而降低细胞内的药物浓度。而另外一些药物则在使用过程中诱导出对某种药物选择性的耐药,如蛋白酶体抑制剂,硼替佐米。在硼替佐米的长期应用过程中,最初治疗有效的多发性骨髓瘤病人,仅有30%的病人继续应用硼替佐米有效,超过一半的病人出现了硼替佐米诱导的耐药。硼替佐米的获得性耐药的机理,可能为硼替佐米诱导了与其特异结合的蛋白酶体亚基β5的基因突变和高表达。近年来,学者们企图用硼替佐米与其他化疗药的联合应用,以及新型蛋白酶体抑制剂的研发,来降低硼替佐米应用过程中出现的诱导耐药。MLN4924,是一种新型的、选择性的类泛素化系统抑制剂,它与类泛素化过程中的供能蛋白ATP/AMP结构类似,选择性的抑制类泛素化活化酶（NEDD8-activating enzyme,NAE）的功能,进而抑制NEDD8由类泛素活化酶向类泛素结合酶的转运。在多种人类细胞肿瘤中,MLN4924都表现出选择性抑制NEDD8与Cullin的结合的特点,而不引起与非Cullin蛋白的交叉反应。在多发性骨髓瘤、淋巴瘤等恶性血液系统肿瘤中,MLN4924都表现出了广阔的活性,比如通过干扰细胞周期S-期的功能而引起细胞死亡。同时,在肺癌和结肠癌等固体肿瘤模型中,MLN4924也表现出抑制Cullin-NEDD8结合的剂量和时间依赖关系,且抑制这些肿瘤细胞的生长。实验目的:我们将着重探讨Cks1b基因在多发性骨髓瘤细胞中的耐药性,分析不同的肿瘤治疗药物对于Cks1b诱导的多发性骨髓瘤细胞耐药的机理,并探讨新型类泛素化抑制剂MLN4924在多发性骨髓瘤中的治疗作用。统计方法:我们使用SPSS 16.0统计软件,检验水平以P<0.05为差异有统计学意义,首先各组数据进行方差齐性检验,而后完全随机行2因素析因设计方差分析,进行各实验组间表达情况的比较。实验结果:1,Cks1b是泛素样蛋白系统耐药基因,而不是多耐药基因我们之前的研究己发现,Cks1b的表达随着多发性骨髓瘤疾病的进程逐渐增高,我们推测在疾病开始的时候,可能只在小部分的骨髓瘤细胞高表达Cks1b,而目前的治疗手段不能有效的杀死这群Cks1b特异高表达的细胞,因此导致病人的治疗失败和骨髓瘤复发。在这项实验中,我们选择了不同类型的抗癌药物作用于多发性骨髓瘤细胞系 OCI-MY5EV（空载体）、OCI-MY5 OE（CKS1B 高表达）;KSM28PEEV、KSM28PEOE上,如NAE抑制剂:MLN4924;泛素蛋白酶体抑制剂（靶向20S）MLN2238;（靶向26S）硼替佐米（Bortezomib,商品名velcade）;嘧啶抗代谢药物:5-FU,抗菌抗癌化学药物:强力霉素（Doxycycline）和骨髓瘤临床常用化疗药物环磷酰胺（cyclophosphamide:CTX）等药物来检测Cks1b的耐药作用。我们选择每种药物IC50值前后共7-8个浓度梯度药物,将其加入到含有105个上述细胞的96孔板中,培养箱中培养48小时,再每孔中加入presto blue viability试剂继续培养箱培养1小时,而后在530 nm/590nm检测fluorescence（荧光）值。结果显示 MLN4924、Bortezomib、MLN2238 治疗的细胞中,与 OCI-MY5 EV组的相比,Cks1b OE组的细胞生长率显著增高,差异有统计学意义（FMLN4924-OCI/K28= 44.994/42.858,P<0.001/0.001;FBortezomib-OCl/K28 =13.729/11.678,P<0.001/0.001;FMLN4924-OCl/K28 = 87.906/7.006,P<0.00,P<0.05）,而 CTX,5-FU,Doxycycline 治疗的 OCI-MY5 EV 和 OCI-MY5 OE 细胞之间的生长指数则没有显著差异,无统计学意义。提示Cks1b可能只对MLN4924、Bortezomib、MLN2238这一类泛素类蛋白系统抑制剂存在耐药性,而不对CTX、5-FU、Doxycycline等其他抗肿瘤药物广泛耐药。相同的结果在KSM28-PEEV、OE 细胞株上得到验证。Foci=0.016,P>0.05,Fk28=0.233,P>0.05;5-FU:Foci=0.108,P>0.05,Fk28=0.228,P>0.05;DOXCY:Foci=0.175,P>0.05,Fk 8=0.199,P>0.05),为了进一步确证Cks1b诱导的选择性泛素样蛋白系统抑制剂耐药,是否通过诱导多药耐药基因的上调而实现,我们用western blot的方法检测了 MDR1、BCRP、以及MRP1三个主要的ATP结合转运蛋白（ABC）超家族成员。结果显示,在OCI-MY5和KSM28-PE两个细胞系中,在过表达和对照组间,未发现MDR1、BCRP、以及MRP1的表达存在显著差异。随后,我们也用功能性的多药耐药试剂盒检测OCI-MY5和KMS28-PE细胞系中,ckslb OE和EV组细胞间的ABC家族成员MDR1,BCRP和MRP1的功能。与蛋白表达水平基本相似,在OCI-MY5细胞系中,分别经过Verapamil、MK-571、Novobiocin处理后的OCI-MY5EV细胞的MAF值分别为0、22.8、22.7,而同样药物处理后的OCI-MY5 OE细胞的MAF值分别为11.7、1.0、0。所有的MAF值均小于25,说明OCI-MY5 EV和OE细胞均未发现通过MDR1,BCRP和MRP1而加强染料的泵出作用,均未发现MDR1,BCRP和MRP1活化而引起的多药耐药。同样的现象也在KMS28-PE的细胞系中被观察到,它们的MAF值分别为,EV:0、18.0、0;OE:1.1、10.4、3.9。2,高表达的Cks1b阻碍MLN4924,Bortezomib抑制的克隆的形成及其诱导的凋亡Cks1b可以阻碍MLN4924和Bortezomib抑制细胞的生长。为了进一步证实Cks1b的泛素样蛋白系统用药的耐药功能,我们使用了克隆形成实验。我们分别选择MLN4924,Bortezomib和CTX三个药物的三个不同浓度以及对照试剂（PBS/DMSO）分别加入到含有 OCI-MY5EV、OE;KSM28PEEV、OE 四个细胞的12孔板中,使其终浓度分别为MLN4924:DMSO、10nm、50nm、100 nm;Bortezomib:0 nm、0.5 nm、2 nm、5 nm;CTX:0nm、10 nm、50 nm、200 nm。从铺好板的第三天开始,每周加药两次,共培养21天,我们首先观察到的是随着药物浓度的升高,克隆形成的数目也逐渐减少,但是与EV组相比,OE组的克隆形成率降低的不明显(MLN4924:23.46%、14.61%、9.23%、2.31%vs.25.00%、21.92%、17.50%、15.76%。Foci=16.190,P<0.001;Bortezomib:23.17%、13.94%、7.21%、2.30%vs.24.51%、20.67%、15.96%、14.90%;Foci=9.504,P<0.001.CTX:20.38%、13.32%、7.11%、1.44%vs.23.56%、14.13%、5.96%、1.53%,交互效应Foci=453.23,P<0.001。相同的结果同时出现在KSM28-PEEV和KSM28-PEOE的细胞中,具体克隆形成率结果如下:（图3.2.1、3.2.2、3.2.3）(MLN4924:21.92%,14.91%,6.44%,2.40%vs.24.32%,19.32%,16.36%,15.76%,Fk28=16.598,P<0.001;Bortezomib:22.30%,15.96%,6.82%,2.11%vs.24.04%,18.55%,17.11%,14.32%,Fk28=10.097,P<0.001。CTX:19.51%,13.07%,5.09%,1.44%vs.22.01%,14.32%,4.13%,1.53%,Fk28=28.811,P=0.987（图/表 3.2.1、3.2.2、3.2.3）。同时,为了进一步观察Cks1b的耐药功能是否通过抗凋亡的形式来实现,我们选择同样三种药物的三个不同浓度,以及对照试剂（PBS/DMSO）在OCI-MY5EV、OE和KSM28-PEEV、OE细胞上检测药物处理48小时后的凋亡情况。我们使用特异性APC结合的抗Annexin-V抗体来检测细胞表面的Annexin-V的表达,并且使用流式细胞仪来检测凋亡细胞的阳性率。结果显示,随着药物浓度的增高,多发性骨髓瘤细胞OCI-MY5和KSM28-PE细胞凋亡率逐渐增加;同时,与OCI-MY5EV细胞相比,OCI-MY5 OE细胞的凋亡率显著减低(MLN4924:6.96%、16.5%、38.6%、78.4%vs.3.04%、11.4%、15.5%、34.2%;Foci=1.176,P<0.001。相同的结果同样出现在Bortezomib的药物处理组(3.26%、16.5%、27.8%、58.6%vs.2.99%、11.1%、16.2%、35.2%,Foci=1257,P<0.001,但是,在DNA合成抑制剂CTX药物处理组,我们没有发现显著的Cks1b 诱导耐药（7.1%、18.6%、29.7%、36.7%vs.6.41%、16.5%、31.8%、35.0%,Foci=1.087,P>0.05。为了讨论Cks1b与MLN4924在细胞周期中的关系,我们向OCI-MY5细胞中分别加入终浓度为70nm的MLN4924,而后测定0,6,12,24,48,72小时细胞周期的变化。结果显示,MLN4924诱导了明显的S期细胞周期抑制,且随着时间的增长,S期的累积呈现剂量依赖关系。但是,与OCI-MY5EV细胞相比,OE细胞的G2M期聚集程度远高于同时期的EV细胞。提示Cks1b降低了 MLN4924引起的S期聚集,诱导更多的S期细胞向G2/M期转换,加快了细胞周期的进展。3,高表达的Cks1b抑制MLN4924引起的Cullin1/Nedd8表达降低普遍认为Cks1b是SCF/SKP2复合物泛素化过程中的调节因子,但是Cks1b与类泛素化的调节关系至今尚不明确。我们用non reduced SDS-PAGE的方法检测类泛素蛋白Nedd8的表达,在Cks1b EV与OE以及Scr和shRNA的膜上,我们发现 OCI-MY5EV、OCI-MY5 OE 和 KMS28-PEEV、KMS28-PEOE 蛋白样品中,随着Cks1b的增高,Culliinl-Nedd8的蛋白表达水平增高,且OCI-MY5和KMS28-PE两个细胞系中的趋势保持一致。同时,与Cullin1-Nedd8的结果一致,UBC12-Nedd8的表达在cks1b高表达的细胞系中也呈现高表达,然而,我们并未发现明显的NAE-Nedd8表达增多。随后,我们在OCI-MY5 Scr、OCI-MY5 shRNA和 KMS28-PE Scr、KMS28-PE shRNA细胞中得到相似的结论,即 Cks1b 的表达与 Cullin1 的 Neddylation 呈正相关,且 Cks1b 对 Cullin1-Nedd8的调节可能是通过抑制已Neddylation的蛋白复合物释放Nedd8。随后,我们探讨了 Cks1b是否通过调节Neddylation来增强肿瘤细胞对MLN4924的耐药性。我们检测了不同浓度的MLN4924（0nm,4nm,10nm和30nm）对 OCI-MY5EV、OCI-MY5 OE 和 KMS28-PEEV、KMS28-PEOE 细胞处理后的Culllin1-Nedd8的表达情况。结果显示,在OCI-MY5和KMS28-PE细胞系中,我们均发现随着MLN4924药物浓度的增加,Cullin1-Nedd8的表达水平降低,而UBC12-Nedd8的表达极低,基本不可见。而且,我们还发现,在OCI-MY5 OE的细胞中,随着MLN4924的药物浓度增加Cullin1-Nedd8的表达下降幅度,远没有OCI-MY5 EV细胞明显,即过表达Cks1b可以部分抑制MLN4924诱导的Cullin1/Nedd8形成降低。其次,我们还发现,在两组不同药物浓度的MLN4924处理后OCI-MY5和KMS28-PE细胞中,随着药物浓度的增加,伴随着降低的Neddylation过程,多泛素化的蛋白“瀑布”表达增多,且OCI-MY5 OE细胞组的泛素化较OCI-MY5 EV细胞组明显增强。4、高表达的Cks1b主要通过抑制SCF/SKP2底物p21的表达来诱导MLN4924的耐药性首先,我们用western blot的方法检测了 Cks1b OE及shRNA细胞中的SCF/SKP2蛋白底物的表达情况。我们发现,Cks1b过表达的OCI-MY5和KMS28-PE细胞系中,较对照组比,SCF/SKP2复合物的蛋白底物p21、p27、p57、p130和CDT1表达均有下降。但是,在KMS28-PE的细胞系中,未检测到p27的表达,这与文献报道的KMS28-PE细胞系p27蛋白发生基因突变相一致。同时,我们也在基因敲除的OCI-MY5和KMS28-PE细胞中发现,这些SCF/SKP2复合物的蛋白底物表达均有所升高。随后,我们在OCI-MY5和KMS28-PE细胞系中,探讨在Cks1b过表达的情况下,两个泛素类蛋白系统抑制MLN4924和Bortezomib对SCF/SKP2复合物的蛋白底物的调控情况。不同浓度的三种药物MLN4924（0nm、4nm、15nm、30nm）,Bortezomib（Onm、0.5nm、2nm、5nm）和 CTX（Onm、5nm、20nm 和 80nm）处理OCI-MY5 OE和EV细胞48小时。我们发现,在MLN4924处理的OE和EV细胞系中,p21、p27、CDT-1和p57蛋白的表达均随着药物浓度的升高而升高。但是,在过表达Cks1b后,蛋白p21的表达几乎不可见,这就提示我们Cks1b可能是通过抑制p21的累积来引起对MLN4924的耐药。这种现象并没有出现在高表达的cks1b诱导Bortezomib的耐药性中。像SCF/SKP2复合物蛋白其他底物一样,OE组的底物升高的表达幅度要显著性小于EV组。这也说明Cks1b可能通过多种途径诱导Bortezomib的耐药。但是,在CTX的药物处理组,在OCI-MY5 EV和OE细胞组之间,未发现这些蛋白增高之间存在差异。这也说明,Cks1b的变化未引起CTX对这些蛋白底物p21、p27、CDT-1、p130和p57调节的变化。5,Cks1b主要通过抑制p21的表达来阻碍MLN4924诱导的骨髓瘤细胞衰老为了阐述Cks1b阻碍MLN4924和Bortezomib诱导的多发性骨髓瘤细胞衰老及其机制。我们分别将不同终浓度的药物MLN4924、Bortezomib、CTX,加入到 OCI-MY5 EV、OCI-MY5 OE 和 KMS28-PE EV、KMS28-PE OE 细胞中。24小时后,我们在镜下观察到细胞变大、扁平等典型的衰老迹象出现,而且细胞衰老的经典SA-β-Gal染色将部分细胞染成蓝绿色。而且,我们还发现无论在OE还是EV的细胞系中,随着药物浓度的增高,SA-β-Gal染色细胞阳性率也逐渐增多。但是,与 OCI-MY5（EV）和 KSM28PE（EV）相比,MLN4924 和 Bortezomib处理的OCI-MY5（OE）和KSM28PE（OE）细胞中衰老细胞的比例上升幅度不显著 Foci=510.675,P<0.001;bortezomib:Foci=107.307,P<0.001）;（Foci=154.822,P<0.001）。此现象没有出现在CTX药物处理的细胞中Foci=0.163,P>0.05。P16/pRB和p53/p21轴是两个主要引起细胞衰老的途径。为了阐述Cks1b阻碍MLN4924,Bortezomib诱导的细胞衰老的机制,我们首先使用以上三个药物处理细胞,并通过western blot试验检测这两个通路的激活情况。在我们的实验中发现p16和p53随着Bortezomib和CTX剂量的增长其表达显著升高。但是在MLN4924治疗的细胞上,除了 p21升高外,并没有看到p16和p53的表达变化。尤其是药物MLN4924,在OCI-MY5cks1bOE组的细胞中,p21的表达基本不可见,但相反在OCI-MY5 cks1b EV组,在每个蛋白泳道上,逐渐增粗的蛋白条带清晰可见。这说明了 cks1b引起MLN4924和Bortezomib治疗过程中的衰亡降低,可能主要是依赖p21途径,这个发现与我们前面观察到的p21在MLN4924治疗Cks1b OE后没有任何变化的特殊性相一致。因此我们能进一步认为Cks1b阻碍MLN4924抑制多发性骨髓瘤细胞的细胞衰老部分依赖于p21的功能。6、Cks1b降低MLN4924和Bortezomib对多发性骨髓瘤的治疗效果为了进一步从体内证明Cks1b可以引起MLN4924和Bortezomib的耐药,我们建立了多发性骨髓瘤小鼠皮下成瘤模型,并通过两种药物治疗来观察体内肿瘤的生长情况。我们取1×106 OCI-MY5 OE和OCI-MY5 EV细胞分别接种于NOD SCID gamma鼠腹部皮下,接种1周后,按PBS（0.1ml,每天）、MLN4924（60mg/kg,1每天）、Bortezomib（1mg/kg,第一、三天/周）分别给老鼠治疗。每周用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径和短径,按公式1/2×长×宽2来计算老鼠皮下瘤体积。实验结果显示,在OCI-MY5 OE和EV细胞组,与PBS对照组相比,MLN4924和Bortezomib对皮下瘤的生长均有一定的抑制作用,证明两组泛素类蛋白抑制剂,对多发性骨髓瘤的治疗均有较好的疗效。在治疗后第15天,NLN4924治疗的OCI-MY5 OE和EV组之间,老鼠的皮下肿瘤体积出现明显的差异（P<0.05）,在治疗后第20天,两组老鼠皮下瘤体积相差接近一倍,这说明Cks1b明显的引起了 NLN4924药物的耐药。我们同样在Bortezomib的治疗组也发现了类似的结果,即Cks1b引起了 Bortezomib的药物耐受。从这组实验可以推论,在多发性骨髓瘤的治疗中,两组泛素类蛋白抑制剂对Cks1b高表达的一部分病人效果较差,因此在临床治疗的药物选择上,应避免应用泛素类蛋白抑制剂,可以选用传统的抗肿瘤药物治疗,或联合用药来避免药物的耐药性。7、MLN4924和Bortezomib对Cks1b低表达的5T33老鼠多发性骨髓瘤模型仍有一定的治疗效果为了进一步了解MLN4924和Bortezomib对老鼠多发性骨髓瘤模型的治疗情况,我们经尾静脉注射5T33细胞到C57BL/KaLwRij老鼠体内,一周后开始MLN4924和Bortezomib药物治疗。经记录老鼠的生存情况,用Kaplan-Meier生存曲线分析,我们发现MLN4924治疗组和Bortezomib治疗组与DMSO对照组相比,两组的生存时间均有统计学意义（p<0.05）。同时,两个治疗组的肿瘤负荷情况观察得到,对照组的老鼠在治疗后第二周即出现血清免疫球蛋白快速增高,在治疗后第三周,平均血清IgG2b的表达超过了 35mg/ml,而MLN4924和Bortezomib治疗组,治疗后第四周血清IgG2b的水平分别为21.37mg/ml和24.70mg/ml。用两组t检验,计算治疗后第二周和第三周两个药物治疗组的血清IgG2b水平与对照组的差异,我们发现MLN4924和对照组以及Bortezomib和对照组,两者均有显著的统计学意义（p<0.001）。而X-ray检测三组老鼠的股骨远端及胫骨近端的骨破坏情况,也发现较对照组X-ray平片相比,两个药物治疗组的胫骨和股骨上的骨破坏空洞较少。结论:Cks1b能阻碍MLN4924、Bortezomib抑制的多发性骨髓瘤细胞的生长,诱导的凋亡和细胞衰老。但是,Cks1b在其他抗肿瘤药物CTX上,为出现交叉耐受的现象,这为临床上多发性骨髓瘤的用药和治疗提供了新的思路。且MLN4924和Bortezomib对低表达Cks1b的5T33老鼠模型仍有一定的治疗效果。