【摘 要】
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研究目的:c-kit+心脏祖细胞（cardiac progenitor cells,CPCs）在缺血性心肌病的治疗中具有重要作用,但该细胞的属性仍未完全清楚。本实验将主要探究:1.从蛋白层面证明c-kit+CPCs可以表达和分泌内皮细胞特征相关的蛋白;2.c-kit+CPCs缺氧处理后,检测c-kit+CPCs表达和分泌细胞因子的变化。研究方法:1.取成年雄性C57BL/6小鼠心脏切成约1mm~3
【基金项目】
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项目名称:Neuregulin-1/ErbB信号传导系统在缺血性心脏病心肌血管重构中的作用及机制,项目合同编号:81460063,项目来源:国家自然科学基金委员会,项目起止时间:2015.01-2018.12
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研究目的:c-kit+心脏祖细胞（cardiac progenitor cells,CPCs）在缺血性心肌病的治疗中具有重要作用,但该细胞的属性仍未完全清楚。本实验将主要探究:1.从蛋白层面证明c-kit+CPCs可以表达和分泌内皮细胞特征相关的蛋白;2.c-kit+CPCs缺氧处理后,检测c-kit+CPCs表达和分泌细胞因子的变化。研究方法:1.取成年雄性C57BL/6小鼠心脏切成约1mm~3碎块,用II型胶原酶和胰蛋白酶消化成单个细胞培养扩增后,免疫磁珠标记进行c-kit+CPCs分选,免疫荧光、流式细胞术检测纯度。2.设置心肌细胞对照组（Car组）、c-kit+CPCs正常培养组（c-kit组）,蛋白芯片检测内皮细胞特征蛋白及相关细胞因子的表达。3.检测缺氧处理对c-kit+CPCs分泌功能的影响:用缺氧小室对分选后的第三代c-kit+CPCs进行缺氧处理,缺氧处理组（c-kit hyp组）在37℃、5%二氧化碳、95%N2中培养,正常组（c-kit nor组）在37℃,5%二氧化碳和21%O2中培养。每组分别设置3、6、12小时。收集细胞培养上清液进行蛋白芯片检测,收集细胞裂解物进行蛋白印记（WB）检测。研究结果:1.根据细胞表面标记c-kit进行阳性分选后获得高纯度c-kit+细胞,细胞呈现梭形、短棒状,形态较分选前明显统一,生长良好。2.分选后第三代细胞进行表面c-kit抗体鉴定,几乎所有细胞呈现c-kit抗体标记的红色荧光,流式细胞术鉴定发现分选前的混合细胞中c-kit+细胞比例约在1.34%,分选后细胞纯度约在95%,且在我们的培养体系下表面标志物可以稳定表达。3.c-kit组比Car组表达增加的因子有:内皮素-1（Endothelin-1）、半胱氨酸蛋白61（Cysteine-rich 61,Cyr61）、FGFbasic、胎盘生长因子2（Placenta Growth Factor-2,Pl GF-2）（P<0.05）,这些因子具有内皮细胞分泌、在血管生成中起一定作用的特点。4.c-kit hyp 3h组比c-kit nor 3h组表达增加的因子有:CXC趋化因子配体16（CXC chemokine ligand 16,CXCL16）、Angiopoietin-1、FGF basic、IL-1beta、人血小板衍生生长因子BB（Platelet derived growth factor,PDGF-BB）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、神经调节蛋白-1（Neuregulin-1,NRG-1）（P<0.05）;c-kit hyp6h组和c-kit nor 6h组,蛋白芯片结果对比未发现有明显差异;c-kit hyp 12h组比c-kit nor 12h组表达增加的因子有:血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）（P<0.05）。研究结论:1.c-kit+CPCs可以表达和分泌多种内皮细胞特征相关蛋白和促血管生成因子。2.适当时间的缺氧处理可以增强c-kit+CPCs的分泌能力,这可能有助于提高c-kit+CPCs分泌功能对缺血性心肌病的治疗效果。3.不同的蛋白对缺氧处理的反应时间不同,NRG-1等在缺氧处理3小时后分泌增加,VEGF在缺氧处理在12小时后增加。
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