【摘 要】
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发现作用于鱼尼丁受体、具有独特的结构、高效杀虫活性和良好环境兼容特性的新型杀虫剂是当前农药相关研究的热点。鱼尼丁受体是由4个分子量为560 kDa亚基构成的大分子跨膜蛋白,难以获得其三维空间结构,限制了作用于鱼尼丁受体不同化合物的结构和活性之间相互关系的研究。本论文利用炔丙基取代氯虫苯甲酰胺和氰虫苯甲酰胺酰胺结构上的N-甲基,得到炔丙基取代的中间体,进而同含有叠氮基的羟基香豆素反应得到荧光标记的荧
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发现作用于鱼尼丁受体、具有独特的结构、高效杀虫活性和良好环境兼容特性的新型杀虫剂是当前农药相关研究的热点。鱼尼丁受体是由4个分子量为560 kDa亚基构成的大分子跨膜蛋白,难以获得其三维空间结构,限制了作用于鱼尼丁受体不同化合物的结构和活性之间相互关系的研究。本论文利用炔丙基取代氯虫苯甲酰胺和氰虫苯甲酰胺酰胺结构上的N-甲基,得到炔丙基取代的中间体,进而同含有叠氮基的羟基香豆素反应得到荧光标记的荧光配体。提取了美洲大蠊腿内的鱼尼丁受体膜蛋白,并且通过蛋白质印迹技术（Western Blot）确认提取物内含有鱼尼丁受体蛋白。测试了荧光配体的杀虫活性、同家蝇和美洲大蠊鱼尼丁受体的亲和结合、建立了荧光偏振分析研究活性化合物同鱼尼丁受体亲和结合的方法,取得了以下创新性研究成果:1、基于活性化合物氯虫苯甲酰胺的结构,设计合成了含有端炔基的氯虫苯甲酰胺和氰虫苯甲酰胺类似物,制备了含有叠氮基的香豆素,然后通过Click反应合成得到了 2个含有氯虫苯甲酰胺和氰虫苯甲酰胺核心结构的荧光配体（如图1）,4个新化合物均通过核磁共振及高分辨质谱的确证。图1含有邻甲酰氨基苯甲酰胺杀虫剂核心结构的荧光配体2、针对小菜蛾,合成的4个新化合物均显示出良好的杀虫活性。化合物Prop-Cl和Prop-CN的致死中浓度LC50值分别为0.08 mg/L和0.34 mg/L。当引入羟基香豆素荧光基团后,荧光配体比丙炔基化合物杀虫活性下降22-32倍,LC50值在2.6-7.6 mg/L。虽然引入了丙炔基和大极性荧光取代基,新的化合物仍保持良好的杀虫活性。3、合成的邻甲酰氨基苯甲酰胺类似物和荧光配体能够有效抑制同位素标记的探针[3H]Chlo同家蝇鱼尼丁受体的结合,Prop-Cl和Prop-CN抑制[3H]Chlo特异性结合的IC50值为16-40 nM,Fluor-Cl和Fluor-CN抑制[3H]Chlo的IC50值为34-39 nM,与氯虫苯甲酰胺（Chlo）和氰虫苯甲酰胺（Cyan）的6-14 nM相比,表明新合成的化合物与氯虫苯甲酰胺作用于家蝇鱼尼丁受体的同一结合位点。同时,荧光配体可以刺激[3H]Ry同家蝇鱼尼丁受体的结合,荧光配体Fluor-Cl和Fluor-CN刺激[3H]Ry特异性结合的EC50为5-7 nM,与Chlo和Cyan的3-15 nM文献值一致。4、从美洲大蠊腿部提取出受体蛋白,并用Western Blot技术确证了所提取的蛋白中含有鱼尼丁受体。5、通过对各种条件的探索和优化,建立了基于荧光偏振技术研究各种结构不同的化合物同鱼尼丁受体亲和作用的方法。利用建立的方法,再次证实结构相似的氯虫苯甲酰胺和氰虫苯甲酰胺及其类似物Prop-Cl,Prop-CN,Fluor-Cl和Fluor-CN作用于鱼尼丁受体上的同一位点,而氟虫双酰胺、鱼尼丁不影响荧光配体和鱼尼丁受体的特异性亲和,说明两类骨架结构不同的鱼尼丁受体杀虫剂作用于不同位点;通过对部分新化合物的测试,发现能够同鱼尼丁受体上氯虫苯甲酰胺作用位点亲和结合的化合物也具有良好的杀虫活性。本文建立的研究方法在一定程度上可以代替同位素标记技术和荧光测试钙离子的方法研究活性化合物同鱼尼丁受体的相互作用,对于方便、安全、快捷发现作用于鱼尼丁受体的新化合物具有促进作用。
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