水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性风险评估及抗性机制研究

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水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)是一种重要的土传病原真菌,可导致水稻纹枯病的发生和危害,目前生产中主要采用化学措施防治该病害。噻呋酰胺属于琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHIs),对水稻纹枯病菌特效;有关其抗药性相关研究鲜有报道,其抗性风险和抗性机制尚不明确。本文针对水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性风险和抗性机制开展了相关研究,取得如下结果:1)明确了噻呋酰胺的抑菌谱。噻呋酰胺对立枯丝核菌、禾谷丝核菌、玉米瘤黑粉病菌、玉米丝黑穗病菌和小麦散黑穗病菌均具有明显的抑菌活性;对核盘菌、茄链格孢菌、稻梨孢病菌和禾顶囊壳菌也具有一定的抑制效果;对辣椒疫霉、根霉等其他10种供试病原菌无抑制作用。2)测定了水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的敏感性,建立敏感性基线。226株敏感菌株的平均EC50值为0.0351(±0.0186)μg/mL,不同年份和地区采集的菌株敏感性未出现明显偏移,敏感性分布呈单峰曲线。敏感性基线的建立为田间抗药性监测提供参考。3)获得了系列抗药性突变体。田间自发突变菌株GD-1抗性倍数为24.66倍。室内药剂驯化和紫外诱变共获得16株抗性突变体,突变频率为10-3~10-4。其中T2突变体的抗性倍数(RF)最高,为敏感菌株的272.32倍,其余抗性突变体的抗性倍数分布在14.54~62.79之间。4)揭示了水稻纹枯病菌对噻呋酰胺的抗性机制。克隆了水稻纹枯病菌中编码琥珀酸脱氢酶的四个基因,发现突变体sdhB基因975位核苷酸存在C与T的杂合状态,引起249位的组氨酸突变为酪氨酸。将其分为异核突变体(RF<100倍的低中抗突变体)和同核突变体(RF>250倍的高抗突变体)两类。药剂处理下sdhB基因无过量表达。分子对接发现2WDQ晶体SDHB亚基的207位组氨酸突变为酪氨酸后,噻呋酰胺与SDHDY83和水分子的氢键减少,组氨酸与血红素的盐桥作用被破坏,分子间结合力减弱,亲和力打分值由6.03降为3.83,表明点突变可能是水稻纹枯病菌对噻呋酰胺产生抗性的原因。5)探究了水稻纹枯病菌的抗药性进化。在无药和药剂选择压下,将原生质体再生菌株在离体平板和活体植株上连续转代。结果表明敏感菌株和抗性纯合菌株均保持其药剂敏感性和基因型不变,而抗性杂合菌株则具有从杂合状态进化为纯合突变体的趋势,并不受药剂选择压的影响。6)进行了敏感菌株与抗性突变体的生物学性状研究。结果表明,抗性群体的生存适合度较好,为中等水平的抗性风险,可能成为优势群体。噻呋酰胺与苯醚甲环唑等8个非SDHIs药剂之间无交互抗性关系,与同类的啶酰菌胺、戊苯吡菌胺、萎锈灵和酚菌氟来呈正交互抗药性;与灭锈胺之间有负交互抗性关系,氟吡菌酰胺对水稻纹枯病菌无抑制效果。7)建立了抗药性菌株的分子检测方法。基于点突变导致的抗性菌株sdhB基因的NlaIV内切酶位点减少,建立了 CAPS分子检测方法;设计了 AS-PCR特异性引物,可以有效鉴定、区分敏感菌株和抗性突变体。8)研制了噻呋酰胺的复配制剂。筛选获得了噻呋酰胺、井冈霉素和咪鲜胺按照1:5:2的比例三元复配的杀菌剂配方,其16%噻·井·咪悬浮剂对水稻纹枯病、稻瘟病和稻曲病均有良好防治效果,可用于水稻三种病害的防治。
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