牛角地黄方通过介导CaN-NFAT2信号通路干预原发性免疫性血小板减少症的免疫调节作用研究

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目的:研究ITP大鼠模型的免疫病理状态;通过CaN-NFAT信号通路,探讨牛角地黄方对ITP大鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞Foxp3的影响,阐述其提升并稳定血小板数的免疫调节机制。方法:将30只SD大鼠随机分成实验组、模型组和正常对照组,每组各10只。实验组和模型组SD大鼠予APS法制作成ITP大鼠模型。于造模第7天实验组予牛角地黄方干预,模型组和正常对照组予生理盐水干预。干预4W后处死各组大鼠,用全自动血小板分析仪检测外周血血小板数,骨髓细胞形态学检测巨核细胞数,ELISA检测血清IL-10、TGF-β1浓度,流式细胞术检测干预后各组大鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞数,RT-PCR检测外周血单个核细胞FOXP3mRNA的表达,Western blot检测外周血单个核细胞CaN、NFAT2蛋白水平。以此评估ITP大鼠模型的免疫病理和牛角地黄方的干预机制。结果:(1)与正常对照组大鼠相比,模型组ITP大鼠皮肤紫癜和消化道出血症状显著,两者比较差异有统计学意义(10VS0只,4VS0只,P<0.05);模型组ITP大鼠外周血血小板数和骨髓巨核细胞数减低,两者比较差异有统计学意义(664±296VS957±163×109/L,234±114VS1235±177个,P<0.05);模型组ITP大鼠血清IL-10和TGF-β1浓度降低,两者比较差异有统计学意义(270.78±88.08VS434.52±29.71pg/ml,163.04±51.94VS422.13±75.49pg/ml, P<0.05);模型组ITP大鼠外周血CD4+T淋巴细胞数增多、CD4+CD25+调节性T细胞数减少,两者比较差异有统计学意义(12.54--+2.39VS2.85±0.87%,0.48±0.33VS5.96±0.89%,P<0.05);模型组ITP大鼠外周血单个核细胞Foxp3mRNA、CaN、NFAT2表达减少,两者比较差异有统计学意义(0.52±0.26VS2.65±0.64(E-3),0.37±0.15VS0.83±0.08,0.28±0.06VS0.82±0.07,P<0.05);(2)与模型组相比,实验组ITP大鼠经牛角地黄方干预后外周血血小板数和骨髓巨核细胞数增多,且紫癜显著得到改善,两者比较差异有统计学意义(869±161VS664±296×109/L,789±92VS234±114个,10VS2只,P<0.05);实验组ITP大鼠经牛角地黄方干预后血清IL-10和TGF-β1浓度增高,两者比较差异有统计学意义(328.41±56.88VS270.78±88.08pg/ml,221.08±61.94VS163.04±51.94pg/ml,P<0.05);实验组ITP大鼠经牛角地黄方干预后外周血CD4+T淋巴细胞数减少、CD4+CD25+调节性T细胞数增多,两者比较差异有统计学意义(7.41±0.61VS12.54±2.39%,2.99±0.58VS0.48±0.33%,P<0.05);实验组ITP大鼠经牛角地黄方干预后外周血单个核细胞Foxp3mRNA、CaN、NFAT2表达均增多,两者比较差异有统计学意义(1.72±0.61VS0.52±0.26(E-3),0.61±0.14VS0.37±0.15,0.50±0.08V50.28±0.06,P<0.05)。但与正常对照组相比,实验组ITP大鼠外周血血小板数和骨髓巨核细胞数、血清IL-10和TGF-β1浓度、CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+调节性T细胞数、Foxp3mRNA和CaN、NFAT2表达未达正常水平,两者比较差异有统计学意义(869±161VS957±163×109/L,789±92Vs1235±177个,328.41±56.88vs434.52±29.71pg/ml,221.08±61.94VS422.13±75.49pg/ml,7.41±0.61Vs2.85±0.87%,2.99±0.58VS5.96±0.89%,1.72±0.61Vs2.65±0.64(E-3),0.61±0.14VS0.83±0.08,0.50±0.08VS0.82±0.07,P<0.05).结论:(1)被动免疫状态下APS法建立ITP大鼠模型易引起紫癜症状,并且外周血CD4+CD25+调节性T细胞数和Foxp3表达均减少,符合ITP自身免疫耐受失衡的病理机制。(2)牛角地黄方可以通过促进ITP大鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞增殖,增加抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1的分泌,减少CD4+T细胞对自身血小板的破坏,从而改善ITP大鼠细胞免疫紊乱状态。(3)牛角地黄方可以通过免疫调控信号CaN-NFAT2增强CD4+CD25+调节性T细胞Foxp3的转录水平,促使ITP大鼠CD4+CD25+调节性T细胞增殖,从而使ITP大鼠恢复自身免疫耐受,从本质上提升和稳定血小板数。
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