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甜瓜（Cucumis melo L.）以其香甜可口、香气袭人的品质深受广大消费者钟爱。黑龙江省是我国薄皮甜瓜的重要商品基地,薄皮甜瓜生产面积高达7万hm2左右。甜瓜的品质特别是糖分的含量是影响效益的关键因素,而果实中的糖分主要由光合作用产物通过相应的代谢过程转化形成,如果光合作用受阻势必影响甜瓜糖分的转化。叶片是光合作用的器官,叶色突变直接影响作物的光合作用。叶色突变体对研究植物的叶绿素的生物合成、光合作用机理、叶绿体的结构与功能以及叶绿体生理生化过程、质体遗传、质体-核信号传递以及蛋白-蛋白互作等具有特殊研究价值。在育种工作中,叶色突变作为直观的形态学标记用于杂交制种和良种繁育过程中具有重要意义。甜瓜叶绿素缺失突变体,是栽培品种自发突变产生的突变,目前对叶色变异的机理尚未明确,特别是突变体对光合作用的影响还不清楚,因此通过对突变体光合特征、抗氧化生理特征以及叶绿体蛋白表达差异性进行研究,并以此为突破口研究突变体叶绿体代谢路径以及生理变化,以及基因突变相关的分子机制,且应用相关理论提高甜瓜品质。主要研究结果如下:1.甜瓜叶绿素缺失突变体整个生长周期都较野生型矮小,果实大小、折光糖含量以及结果数量与野生型差别不显著。突变体叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量都显著低于野生型,类胡萝卜素含量无显著差异,说明叶色变化主要由总叶绿素减少导致。突变体叶绿素前体物质UrogenⅢ显著减少,推测叶色突变可能与UrogenⅢ合成减少有关。并且突变体中有大量叶绿素前体物质5-氨基乙酰丙酸（ALA）积累。2.甜瓜突变体净光合速率、气孔导度和蒸腾速率降低,胞间CO2浓度升高。突变体叶绿素荧光参数除ΦPSⅡ没有显著变化外,F0、Fm、Fv/Fm、q P值都显著下降。突变体光补偿点升高,光饱和点降低;CO2补偿点降低,CO2饱和点升高;并且净光合速率日变化也较低。这说明叶绿素减少对突变体光合作用影响较大,但是突变体通过提高q N来保护PSⅡ,减少光抑制,并且增加胞间CO2浓度以及升高CO2饱和点等方式提高光合效率。3.甜瓜突变体中电导率升高,活性氧分子(O2·-、H2O2)与丙二醛含量增加,说明突变体细胞处于氧化胁迫状态。突变体中LOX活性下降,以及SOD、POD、CAT以及APX活性显著升高,这可以减少细胞内超氧化反应发生及清除多余的活性氧分子。同时脯氨酸含量升高,这对减少膜脂氧化以及保持质膜渗透性有重要作用。4.运用比较蛋白质组学方法分析了突变体和野生型甜瓜叶绿体蛋白质组的差异表达。分离突变体和野生型甜瓜的叶绿体并提取叶绿体蛋白,经Label-freeLC-MS/MS分析共检测到2569个多肽,来自于475个蛋白,其中189个上调表达,32个下调表达,选取表达比>+/-4.0且P<0.05蛋白作为差异表达蛋白,并运用|log2Ratio|≥1且p<0.05进行校正。经过GO分析和Pathway分析显示不同表达蛋白主要与结合、催化反应、细胞结构、物质转运和抗氧化等生物过程相关。差异表达蛋白涉及到卟啉和叶绿素代谢、碳代谢、核糖体、乙醛酸、碳固定等代谢过程。ALA是叶绿素合成的前体物质,谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶（GSAM）是ALA合成过程的主要酶,突变体中GSAM的丰度增加了6.08倍,同时GSAM辅酶磷酸吡哆醛的合成蛋白也增加了5.02倍。光系统亚基蛋白则主要下调表达,psa D、psa A、psa C、psa B和psb L分别下降2.01、1.59、1.43、1.11和1.06倍。碳固定过程中的多个酶的表达也发生了变化,如1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基、甘油醛3-磷酸脱氢酶亚基,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、叶绿体转酮酶分别上调2.31、2.5、2.5和3.75倍。RNA识别蛋白（RRM）表达降低了5.22倍,脂肪氧合酶降低了2.95倍,过氧化氢酶（CAT）表达增加6.22倍。以上结果说明叶绿素前体ALA的合成过程与叶绿素缺失关系密切,光系统受到破坏,整个叶绿体内代谢发生改变,并且叶绿体内环境处于氧化胁迫状态。5.甜瓜突变体中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶含量是野生型的3.8倍,苹果酸脱氢酶的含量也都上调表达,并且PEPC、NADP-ME和NAD-ME这三个酶在甜瓜突变体内活性都呈现增强趋势。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶都是C4循环及景天酸代谢过程中重要的酶,并且多条与CO2释放有关KEGG路径发生变化。因此推测在甜瓜中应该存在C4途径,在正常生长环境下甜瓜主要以C3循环方式固定CO2,而在叶绿素缺失或环境胁迫下则加强C4方式固定CO2。6.对突变体和野生型中下调和上调表达差别最大的蛋白RRM和GSAM进行分析,选择适合的多肽序列制备多可克隆抗体。对突变体和野生型叶绿体蛋白进行Western blot杂交分析。试验结果是突变体中RRM蛋白下调表达,而GSAM上调表达,与质谱分析结果一致,说明质谱检测结果可靠,可用于后续研究工作。7.应用实时荧光定量PCR技术对差异表达较大的Actin、RRM、GSAM、CAT、RCA、psa D、AOR、氨基转移酶1和磷酸吡哆醛合成蛋白9个蛋白基因进行m RNA水平上的表达分析。结果显示突变体和野生型的actin和RRM在m RNA水平表达差异不显著,除了RCA其他蛋白在m RNA水平的表达趋势与蛋白表达相反呈现降低表达。这说明突变体中这些蛋白主要在转录水平进行调控表达。8.RRM蛋白减少是导致突变体叶绿素缺失的候选基因蛋白,其作用可能与GSAM催化过程密切相关。9.构建了用于敲除RRM基因的Crispr/Cas9表达载体,并成功敲除拟南芥rrm基因,T2代叶色变浅,说明RRM与叶色变化有关。