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【研究背景】胃癌是我国乃至全世界的常见恶性肿瘤之一。最新的流行病学调查显示,胃癌在全球的发病率居恶性肿瘤第五位,死亡率居恶性肿瘤第三位。近年来,随着分子靶向药物、免疫检测点抑制剂的临床推广应用,胃癌的治疗也从传统的手术切除和放化疗进展到生物治疗新时代。然而,胃癌患者的五年生存率仍不足20%。究其原因,主要是胃癌发生发展的分子机制仍未完全阐明。Correa模型认为,胃癌尤其是肠型胃癌的发生经历了慢性非萎缩性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠化生-异型增生-原位癌多个阶段。与胃癌发生密切相关的危险因素包括幽门螺杆菌感染、高盐饮食、胆汁反流等。其中,胆汁反流与胃癌的关系受到了广泛的关注。多项研究显示,萎缩性胃炎和肠化生患者胃液胆汁酸浓度显著高于非萎缩性胃炎患者。随访研究也发现,胃液胆汁酸浓度高的患者发生胃癌的比率也显著高于胃液胆汁酸浓度低的患者。我们前期研究发现,胆汁酸能够诱导胃上皮细胞表达多种肠型标志分子,胆汁酸的核受体FXR通过促进SHP、miR-92a、miR-21等多种分子的表达而介导胆汁酸诱导肠上皮化生的作用,FXR在肠化生组织和胃癌组织的表达水平显著高于慢性胃炎组织。由此提示,FXR可能参与了胃癌的发生发展。在此基础上,本研究拟进一步探讨FXR对胃癌细胞多种恶性表型的影响,为深入理解胆汁酸与FXR调控胃癌发生提供新的实验依据。第一部分FXR在胃癌组织及胃癌细胞系中的表达【目的】检测FXR在胃癌组织及其配对癌旁组织中的表达情况,探讨FXR的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系,明确其潜在的意义。【方法】1.利用免疫组织化学染色法,检测FXR在42例胃癌及癌旁组织中的表达情况,半定量法判定组织染色结果,Pearsonχ2检验用于分析FXR与胃癌患者临床病理参数的关系,Kaplan-Meier法用于估计生存率,并描绘生存曲线,Log-rank检验用于比较生存率的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。2.利用Western blot和RT-PCR检测FXR蛋白质和mRNA在胃癌细胞系AZ-521、BGC-823、MKN-45、SGC-7901和人胃粘膜上皮细胞GES-1中的表达。【结果】1.免疫组织化学染色结果显示,FXR阳性颗粒主要位于细胞核中,FXR在胃癌组织中的高表达率显著低于对应的癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。FXR在胃癌组织中的表达水平与胃癌患者的TNM分期和肿瘤分化程度有统计学意义(P<0.05),但与患者的年龄、性别无统计学意义(P>0.05)。FXR高表达胃癌患者五年生存率显著优于FXR低表达的患者(P<0.05)。2.Western-blot和RT-PCR检测结果表明,FXR在GES-1细胞和五种胃癌细胞中均有表达。其中,FXR在胃癌细胞BGC-823中表达水平最高,在胃癌细胞MKN-45中表达水平最低。【结论】1.FXR在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,FXR在胃癌组织中的高表达率与肿瘤TNM分期和分化程度有统计学意义,与患者五年生存率呈正相关。提示FXR可能参与了胃癌发生发展。2.FXR在多种胃癌细胞系中均有表达,以BGC-823表达最高、MKN-45表达最低,为后续的细胞生物学研究奠定了基础。第二部分FXR对胃癌细胞恶性表型的调控作用【目的】探讨FXR对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等多种恶性表型的调控作用。【方法】1.借助针对FXR的shRNA重组慢病毒载体(LV-FXR-shRNA)和胃癌BGC-823细胞,构建FXR敲低的胃癌细胞系;借助FXR的重组慢性病毒载体(LV-FXR)和胃癌MKN-45细胞,构建FXR过表达的胃癌细胞系。2.利用FXR激动剂GW4064处理胃癌细胞BGC-823、MKN-45,改变细胞内源性FXR的活性。3.采用CCK-8实验观察胃癌细胞BGC-823和MNK-45的体外增殖能力。4.借助流式细胞仪检测胃癌细胞BGC-823细胞周期分布以及自发性凋亡。5.利用Transwell实验检测胃癌细胞BGC-823和MNK-45的体外迁移和侵袭能力。6.采用裸鼠皮下成瘤实验检测胃癌细胞BGC-823和MNK-45的体内成瘤能力。【结果】1.Wesrtern blot和RT-PCR检测结果表明,本研究成功建立了FXR敲低的BGC-823和过表达FXR的MKN-45。2.CCK-8检测结果显示,1μM的GW4064对胃癌细胞BGC-823和MNK-45的体外增殖无明显影响,而5μM的GW4064显著抑制了BGC-823和MNK-45的体外增殖(P<0.05)。3.CCK-8检测结果显示,敲低FXR的表达显著加快了BGC-823细胞的增殖速度,过表达FXR则显著减慢了MKN-45细胞的增殖速度。而无论哪一种胃癌细胞,应用GW4064均能抑制其体外增殖。4.细胞周期检测表明,对于BGC-823细胞,敲低FXR的表达能够减少G0/G1细胞比例并显著增加S期细胞比例;而对于MKN-45细胞,过表达FXR能够显著增加G0/G1细胞比例并显著降低S期细胞比例。5.流式细胞仪检测结果提示,敲低FXR的表达对BGC-823细胞的自发性凋亡无明显影响。6.Transwell实验结果显示,敲低FXR的表达显著增强了BGC-823细胞的迁移和侵袭能力,过表达FXR显著抑制了MKN-45细胞的迁移和侵袭能力;而无论哪一种胃癌细胞,应用GW4064均能抑制其体外迁移和侵袭。7.裸鼠皮下成瘤实验结果表明,敲低FXR的表达能够促进BGC-823细胞的体内成瘤能力,而过表达FXR则显著抑制了MKN-45的体内成瘤能力。【结论】本研究发现,敲低FXR的表达能够增强胃癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,增加S期细胞比例,促进体内成瘤;而过表达FXR或激活FXR则发挥相反的效应。提示FXR能够抑制胃癌细胞的多种恶性表型,在胃癌发生过程中可能起负向调控作用。