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研究背景:乳腺癌居于全球女性癌症死亡原因的首位。三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一种亚型,其分子表型呈雌激素受体(ER)阴性、孕激素受体(PR)阴性以及人类表皮生长因子受体2(HER2)阴性,约占全部乳腺癌的10-20%。TNBC由于缺乏有效的治疗靶点,往往预后不佳。乙酰肝素酶(HPSE)是哺乳动物体内唯一一种用于切割硫酸乙酰肝素(HS)侧链的β-D-葡萄糖内切糖苷酶,通过切割HS侧链过程重塑细胞外基质(ECM)结构,释放具有生物活性的小分子物质,如生长因子、细胞因子等,协助肿瘤的侵袭与转移,促进肿瘤血管生成,有助于肿瘤的发展。HPSE在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的恶性进展呈正相关。有研究发现,乙酰肝素酶具有调控细胞基础自噬过程的作用。自噬是一种进化保守的细胞通过溶酶体进行物质降解代谢的过程,一般认为,自噬在肿瘤的发生、发展过程中具有双刃剑的效果。在肿瘤产生之前,自噬可以清除损伤的细胞器或异常合成的蛋白质,减轻炎症反应,避免DNA损伤,预防肿瘤的发生;当体内出现肿瘤细胞时,自噬可以激活免疫细胞的抗原呈递功能,激活T细胞,增强免疫应答功能清除肿瘤细胞。然而肿瘤发生之后,肿瘤细胞可利用自噬作为其必要的生存机制,通过自噬过程为肿瘤细胞的生存和发展提供营养物质和能量支持,以此应对外周环境压力,获得增殖或转移的机会。由于TNBC目前仍然缺乏有效的治疗靶点,且易对治疗产生抵抗,寻找有效的辅助治疗手段提高TNBC的疗效十分重要。研究者对于包括传统中医药在内的补充替代治疗日益关注。千百年来,中药被广泛用于包括癌症在内的各种疾病的治疗。中药结合常规现代治疗有助于提高肿瘤疗效,减轻治疗毒副作用,改善肿瘤患者的生存质量。郁仁存教授、王笑民教授根据多年临证经验总结“益气活血解毒法”,并据此治则创立相关方剂,在临床上治疗各类恶性肿瘤取得了良好的疗效。基于益气活血解毒法,我们选择四种中药单体联合应用并评价其疗效。这些单体包括黄芪甲苷(提取自黄芪,代表“益气”),龙葵碱(提取自植物龙葵,代表“解毒”),莲心碱(提取自莲子,代表“解毒”),川芎嗪(提取自川芎,代表“活血化瘀”)。我们将这四种单体组合简称“SANT”,并对其在肿瘤体内外模型中进行研究。研究目的:评价益气活血解毒中药单体组合SANT对MDA-MB-231 Hpa/Mock肿瘤的影响并分析相关机制。研究方法:在本研究中,我们首先利用数据库进行肝素酶表达与乳腺癌患者生存的相关性分析。利用MTS、trans-well和划痕实验评价SANT对肿瘤细胞增殖、迁移的影响。共聚焦实验用于观察SANT处理后231-Hpa细胞中GFP-RFP-LC3蛋白的变化。免疫印迹实验用于检测相关蛋白标志物表达。动物实验用于评价SANT在体内的疗效与安全性。最后我们采用人类自噬相关PCR微阵列和血管生成蛋白微阵列用于相关机制探索。研究结果:1.HPSE在多种癌症类型中高表达,乳腺癌中HPSE mRNA表达水平超过正常乳腺组织2倍以上。HPSE高表达的乳腺癌患者无复发生存期(P=1.7e-12)与总生存期(P=0.00016)都显著短于HPSE低表达的乳腺癌患者。TNBC患者的HPSE转录效率高于非三阴性乳腺癌患者。2.肿瘤细胞231-Hpa具有显著上调的肝素酶水平,231-Hpa细胞内LC3B-I/-Ⅱ转化率也显著高于231-Mock细胞(P=0.0003)。在乳腺癌原位移植瘤模型中,免疫荧光显示231-Hpa移植瘤HPSE表达显著升高;231-Hpa组肿瘤负荷(0.608g 与 0.437g,每组≥6 只,P=0.0242),肺重(0.167g 与 0.148g,每组≥6只,P=0.0164)均显著高于对照组。231-Hpa组Ki-67染色与CD31染色均显著高于 231-Mock 组。3.体外实验:经过24小时处理,龙葵碱在0-64μM浓度范围将231-Mock细胞生存率降低近50%,231-Hpa细胞生存率降低约60%;经过48小时处理,龙葵碱对于231-Mock细胞抑制率为68.93%,对231-Hpa细胞抑制率为81.06%。甲基莲心碱(NEF)处理细胞24-48h后也达到60-80%的抑制率。黄芪甲苷和川芎嗪对肿瘤细胞增殖影响不明显。在Trans-well实验中,与对照组相比,SANT对231-Hpa细胞迁移的抑制率达79%,对231-Mock细胞迁移抑制率达72%。划痕实验也取得类似的结果,经过24小时SANT处理,231-Hpa细胞的划痕愈合面积下降了 51.5%,231-Mock细胞的划痕愈合面积下降了 40.6%。SANT在免疫印迹实验中可轻度降低活性形式HPSE的表达,对惰性形式HPSE的影响不明显。SANT和PI-88(肝素酶抑制剂)在体外均可轻微降低肝素酶活性带的表达。在荧光共聚焦观察实验中,转入GFP-RFP-LC3B标记的231-Hpa细胞经过SANT药物处理12h后,可以观察到大量LC3蛋白与溶酶体融合形成的黄色斑点,表示自噬过程的发生。Western实验可见,SANT处理细胞不同时间后引起了 LC3B-Ⅱ表达的升高,SANT与自噬抑制剂CQ联用可使LC3B-Ⅱ表达进一步升高,表明自噬流量的发生。4.体内实验中,SANT与PI-88均可以显著抑制肿瘤的生长(SANT与对照组,360.59 与 598.32mm3,P=0.0381;PI-88 与对照组,3 64.93 与 598.32mm3,P=0.0344)。SANT、PI-88组肿瘤重量较对照组也明显下降(SANT与对照组,0.29与 0.54g,P=0.0046;PI-88 与对照组,0.37 与 0.54g,P=0.0262)。肿瘤组织的免疫组化染色中,与对照组相比,SANT显著降低了 Ki-67表达(17.76±3.41%与7.52±2.02%,P<0.0001),效果优于PI-88组。SANT明显抑制了微血管(MVD)(57%,P<0.0001)与血管生成拟态(VM)(33%,P=0.0019)的形成,但 PI-88抑制血管生成的效果更佳。安全性评价中,SANT在体内对小鼠的生化指标无明显影响。5.机制探索:对肿瘤组织进行人类自噬相关基因PCR微阵列检验结果显示,SANT处理显著上调了部分自噬过程相关基因,包括ATG10,ATG16L1,ATG16L2,ATG4B,ATG4D,ATG9A等,而PI-88处理组显著下调了一些自噬相关基因如AMBRA1,ATG16L1,ATG4D,BAD,BCL2L1等。肿瘤血管生成相关蛋白微阵列研究结果显示,SANT治疗组中HB-EGF,thrombospondin-2,amphiregulin,leptin,IGFBP-9,EGF,coagulation factor Ⅲ,MMP-9(前体及活性形式)表达上升,serpin E1,platelet factor 4表达下降。结论:肝素酶(HPSE)高表达常见于侵袭性乳腺癌患者中,与不良预后相关。HPSE促进肿瘤增殖,引起小鼠体内肺转移增多,在体外提高了肿瘤细胞自噬水平。体外研究中,SANT抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并增强肿瘤细胞的自噬水平。体内实验中,SANT在小鼠体内抑制肿瘤生长与血管生成过程。SANT对自噬相关基因或血管生成相关蛋白表达具有调控作用,可能与其肿瘤抑制作用相关。SANT是一种具有前景的用于三阴性乳腺癌辅助治疗的药物,这种药物组合研究拓展了天然化合物的应用思路。