背景:多发性骨髓瘤是常见的血液系统恶性肿瘤,虽然近年对多发性骨髓瘤的治疗取得到较大的进展,但MM仍然是无法治愈的疾病,大多数患者会出现复发并需要进一步的治疗,而此时的由于药物的不良反应以及耐药问题会使得复发的多发性骨髓瘤疗效不佳,因此需要寻找新的药物和靶点对多发性骨髓瘤进行治疗。单克隆抗体是由B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,目前已广泛用于疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究。肝再生增增强因子（ALR）,也称为GFER,是参与各种生命过程的重要蛋白质。ALR有两种亚型,分子量分别为23 k D和15 k D,23KDALR主要定位于细胞线粒体,参与氧化磷酸化等能量代谢等,是细胞存活所必须的。15KDALR主要分泌到细胞外,与细胞生长、增殖相关。课题组在前期实验发现骨髓瘤细胞中ALR高表达,对骨髓瘤细胞有保护作用,但是具体机制还不清楚。但是采用过表达或沉默方式从基因层面进行干预会同时影响到23KDALR和15KDALR,无法区分究竟是哪种亚型ALR发挥作用。而且从基因层面上干预还会影响到正常组织中的23KDALR。利用单克隆抗体抗体特异结合细胞外的15KDALR则不会影响到存在于线粒体中的23KDALR,有利于单独研究15KDALR的作用,还减少了对正常组织的影响。因此我们拟通过使用单克隆抗体阻断分泌到细胞外的ALR以研究15KDALR在骨髓瘤中的作用,并探讨相应机制,希望为多发性骨髓瘤的治疗提供新的思路和靶点。方法:课题组前期合成了15KDALR重组蛋白,运用杂交瘤技术制备15KDALR单克隆抗体,应用ELISA和western blot方法对制备的单克隆抗体进行验证。在骨髓瘤细胞系中加入15KDALR单克隆抗体,以阴性杂交瘤腹水和PBS作为对照,采用细胞计数、CCK8方式观察细胞存活率以明确单克隆抗体是否对骨髓瘤细胞有影响,采用流式检测凋亡,western blot检测凋亡相关蛋白,采用edu方式检测细胞增殖情况以明确单克隆抗体是从增殖方面还是凋亡方面影响骨髓瘤细胞。在体内实验方面,建立小鼠皮下移植瘤模型,分为单克隆抗体治疗组,阴性腹水治疗组和PBS组,分别在肿瘤中心后周围皮下注射15KDALR单克隆抗体腹水、阴性腹水和PBS,观察肿瘤的生长速度,治疗结束后观察肿瘤的体积、质量。为了进一步研究15KDALR单克隆抗体对骨髓瘤影响的机制,采用RNA-seq技术分析15KDALR单克隆抗体处理骨髓瘤细胞后与阴性腹水处理骨髓瘤细胞后的基因表达的差异,将差异基因与数据库中已注释功能的基因,可以分别从功能、参与的生物途径及细胞中的定位对差异基因进行简单注释,了解差异基因富集在哪些生物学功能、途径或者细胞定位。通过KEGG数据库功能注释可以寻找差异基因富集的信号通路,寻找15KDALR单克隆抗体影响骨髓瘤细胞的可能机制。在RNA-seq分析的基础上采用RT-PCR、western blot、细胞周期检测方式对RNA-seq的结果进行验证,进一步证实单克隆抗体影响骨髓瘤的机制。结果:在使用15KD重组人肝再生增强因子免疫小鼠后,通过ELISA检测小鼠血清中的抗体效价达到104,经过细胞融合及多次检测,对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行有限稀释单克隆培养,最终成功筛选出2株能稳定分泌15KDALR单克隆抗体的杂交瘤细胞,将杂交瘤注射到小鼠腹腔产生含有单克隆抗体的腹水,经ELISA验证腹水中抗体效价106,western blot证实了单克隆抗体能特异结合15KDALR重组蛋白,经单克隆抗体亚型鉴定制备单克隆抗体亚型为Ig M。通过western blot检测发现在3种人多发性骨髓瘤细胞系中U266细胞系的15KDALR的表达量最高,因此选取U266细胞系作为后续实验细胞系。在U266细胞中加入15KDALR单克隆抗体处理,以阴性杂交瘤产生的腹水和PBS作为对照,CCK8结果表明15KDALR单克隆抗体能抑制U266细胞的活性,抑制程度与抗体浓度和作用时间呈正相关,在腹水与培养基比例为1:10,作用时间为72h时,细胞活性将至正常对照的50%,因此选用腹水浓度为1:10,作用时间72h为后续实验条件。在此条件下进行流式凋亡检测,与阴性腹水组和PBS组相比,单克隆抗体腹水组的凋亡率并未明显增加,差异无统计学意义。行western blot检测凋亡相关蛋白,Bax/Bcl-2比例,Caspase3和Cleaved-Caspase3的表达量也无显著差异。但是在使用15KDALR单抗抗体处理的同时加入表阿霉素刺激细胞诱导凋亡后,15KDALR单克隆抗体腹水组的凋亡率较阴性腹水组和PBS组明显升高,差异有统计学意义。使用小鼠骨髓瘤SP2/0细胞建立Balb/c普通鼠皮下移植瘤模型后,用15KDALR单克隆抗体腹水治疗组的肿瘤生长速度与阴性腹水和PBS组相比明显延缓,治疗结束后单克隆抗体腹水治疗组的肿瘤体积和质量也明显小于对照组。运用RNA-Seq技术对15KDALR单克隆抗体腹水治疗组和阴性腹水对照的U266细胞进行转录组测序,通过对差异基因进行分析,共发现289个显著上调和138显著下调的基因。基因富集分析结果显示生物进程方面差异基因主要集中在核有丝分裂、细胞周期、细胞分裂方面。分子功能部分差异基因主要集中在核酸结合、DNA结合方面,细胞定位部分差异基因主要分布在中心体,细胞内。对差异基因表达的蛋白进行了蛋白质-蛋白质相互作用网络分析筛选出的10个hub genes分别是CDK1,SMC3,KIF11,SMC4,NDC80,NCAPG,TTK,CENPE,NUF2和CENPU。这些基因均与细胞周期有关。Pathway分析发现在显著性信号通路中,MAPK通路,Jak-STAT信号通路和cell cycle信号通路在这处于相对核心的地位。运用PCR验证了15KDALR单克隆抗体治疗组、阴性腹水组和PBS组中10个hub genes,结果表明hub genes的变化情况与RNA-Seq分析结果趋势一致,但是TTK和CENPU的变化在不具有统计学差异。Western blot验证了MAPK、Jak-STAT和cell cycle信号通路中的关键蛋白,结果与阴性腹水组和PBS组相比,单克隆抗体腹水治疗组p44/42和p-p44/42的表达下调,p38和p-p38的表达无显著差异。单克隆抗体腹水治疗组JNK表达下调,而p-JNK表达上调STAT3的表达轻微下调,而p-STAT3则显著下调,细胞周期相关蛋白CDK1和cyclin D1表达下调。结果表明ERK1/2、JNK、STAT3和Cell Cycle是15KDALR单克隆抗体影响U266细胞的主要通路。结论:15KDALR单克隆抗体通过阻断分泌到细胞外的ALR能抑制骨髓瘤U266细胞活性,阻断ALR后主要是抑制增殖的作用,而在合并有其他导致细胞损伤因素的情况下,阻断ALR能增加U266细胞的凋亡。15KDALR单克隆抗体能抑制Balb/c普通鼠SP2/0细胞皮下移植瘤的生长。单克隆抗体阻断分泌到细胞外的ALR后,可能是通过ERK1/2,JNK,STAT3和Cell cycle通路发挥作用。