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研究背景:越来越多的研究表明微生物疗法在代谢、感染以及恶性疾病中表现出独特的治疗优势。然而,微生物制剂作为治疗药物存在一定生物安全方面的风险,可能导致感染甚至是致死性感染的发生。且微生物制剂固有的异质性难以保障其治疗效果。探索更为安全和有效的微生物疗法是微生物药物领域的研究热点和难点。微生物来源的生物活性成分可发挥有效的治疗效应,可能代表着一种更可控、可重复和可靠的治疗策略。探寻具有治疗效应的单一微生物来源的生物活性成分并阐明其作用机制具有重要的临床价值。ΔA146Ply是肺炎链球菌溶血素（Pneumolysin,Ply）的无溶血活性突变体。课题组前期意外地发现ΔA146Ply联合盐酸小檗胺（Berbamine,BBM）可显著抑制三阴性乳腺癌进展。ΔA146Ply单独可显著抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力,在小鼠模型中ΔA146Ply可抑制三阴性乳腺癌转移。这些研究结果提示ΔA146Ply具有直接的抗三阴性乳腺癌效应,但ΔA146Ply发挥该效应的分子机制仍不清楚。目的:本研究拟深入探索ΔA146Ply抑制三阴性乳腺癌细胞迁移、侵袭的分子机制,为三阴性乳腺癌的治疗提供新的选择。方法:采用划痕、Transwell试验评价ΔA146Ply对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和小鼠三阴性乳腺癌细胞py8119、4T1迁移、侵袭能力的影响;采用Western blot检测转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1,TGF-β1）、雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,m TOR）信号、自噬、上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白的表达情况;采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测培养细胞上清中的TGF-β1含量;采用流式细胞术检测细胞表面受体Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）和甘露糖受体（Mannose receptor,MR）的表达情况;采用免疫荧光检测ΔA146Ply与细胞表面受体TLR4和MR的结合情况;采用si RNA敲低细胞表面TLR4和MR的表达。结果:1.ΔA146Ply抑制MDA-MB-231、py8119、4T1细胞迁移、侵袭:ΔA146Ply处理MDA-MB-231、py8119、4T1细胞后,划痕实验结果显示ΔA146Ply处理组中划痕的宽度大于阴性对照组;Transwell试验结果显示ΔA146Ply处理组中迁移、侵袭的细胞数目显著低于阴性对照组（p<0.001）。2.ΔA146Ply抑制MDA-MB-231、py8119、4T1细胞发生EMT:ΔA146Ply处理MDA-MB-231、py8119、4T1细胞后,MDA-MB-231细胞内上皮标志物E-cadherin表达增加,而间质标志物N-cadherin、Vimentin、ZEB1的表达在ΔA146Ply处理48 h后降低;py8119、4T1细胞内上皮标志物E-cadherin表达增加,而间质标志物N-cadherin、Vimentin、SNAIL的表达在ΔA146Ply处理48 h后降低。3.ΔA146Ply通过抑制MDA-MB-231、py8119细胞表达TGF-β1从而抑制EMT:ΔA146Ply处理MDA-MB-231细胞后,培养上清中TGF-β1的含量显著降低（p<0.01）,加入TGF-β1蛋白后,ΔA146Ply不能上调E-cadherin、抑制N-cadherin、Vimentin的表达,同时不能抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭;ΔA146Ply处理py8119细胞后,胞内TGF-β1的表达降低,加入TGF-β1蛋白后,ΔA146Ply不能抑制Vimentin、SNAIL的表达,同时对py8119细胞迁移、侵袭的抑制效应减弱。4.ΔA146Ply通过抑制自噬抑制MDA-MB-231、py8119细胞表达TGF-β1:ΔA146Ply处理后,MDA-MB-231、MDA-MB-453、py8119、4T1细胞内的p62水平增加;加入自噬诱导剂雷帕霉素后,ΔA146Ply不能抑制MDA-MB-231细胞分泌TGF-β1,不能上调E-cadherin、抑制N-cadherin、Vimentin的表达,同时不能抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭;加入雷帕霉素后,ΔA146Ply不能抑制py8119细胞表达TGF-β1,不能上调E-cadherin、抑制N-cadherin、Vimentin的表达,同时对py8119细胞迁移、侵袭的抑制效应减弱。5.ΔA146Ply通过激活m TOR信号抑制MDA-MB-231、py8119细胞自噬:ΔA146Ply处理MDA-MB-231、MDA-MB-453、py8119、4T1细胞后,胞内Akt、细胞外信号调节激酶（Extracellular signal–regulated kinase,ERK）、m TOR的磷酸化水平增加;加入Akt的小分子抑制剂MK2206和ERK的小分子抑制剂U0126后,ΔA146Ply不能增加MDA-MB-231、py8119细胞内m TOR的磷酸化水平和p62的水平。6.ΔA146Ply通过激活TLR4和MR激活m TOR信号:MDA-MB-231、MDA-MB-453、py8119、4T1细胞表面同时表达TLR4和MR,且ΔA146Ply直接结合至MDA-MB-231和4T1细胞表面的TLR4和MR受体;采用TLR4和MR的si RNA敲低MDA-MB-231细胞表面TLR4和MR的表达后,ΔA146Ply不能使胞内m TOR的磷酸化水平增加,同时不能抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭;采用TLR4的封闭抗体和甘露糖封闭MDA-MB-231细胞表面的TLR4和MR后,ΔA146Ply不能抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭。结论:本部分研究证实了ΔA146Ply通过激活TLR4和MR受体,激活m TOR信号,抑制三阴性乳腺癌细胞自噬,从而抑制TGF-β1的分泌,抑制EMT,进而抑制细胞的迁移、侵袭能力。为MR的下游信号通路提供了新的理论与实验依据,同时为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的选择。研究背景:第一部分我们已经证实ΔA146Ply通过TLR4和MR受体发挥抗三阴性乳腺癌效应。因此,我们推测ΔA146Ply可直接作用于其他表达TLR4或MR的肿瘤细胞。急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是成年人中最为常见,同时也是死亡率较高的白血病类型。大量的研究表明髓系细胞表面高表达TLR4和MR受体,提示我们ΔA146Ply可能通过TLR4和MR受体直接作用于急性髓系白血病细胞。目的:本部分我们拟探索ΔA146Ply对急性髓系白血病细胞的效应及其发挥该效应的分子机制,为急性髓系白血病的治疗提供新的选择。方法:采用流式细胞术检测人急性髓系白血病细胞KG-1、小鼠急性髓系白血病细胞C1498表面TLR4和MR的表达,以及ΔA146Ply对细胞凋亡、周期的影响;采用Western blot检测凋亡、自噬、m TOR信号相关蛋白的表达情况;采用ELISA检测培养细胞上清中肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）的含量;采用免疫荧光检测KG-1、C1498细胞内微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）斑点的形成情况;采用细胞增殖检测试剂盒（Cell counting kit 8,CCK8）检测细胞增殖情况;采用Transwell试验检测ΔA146Ply对KG-1细胞迁移侵袭的影响。结果:1.ΔA146Ply诱导KG-1、C1498细胞凋亡:KG-1、C1498细胞表面均同时表达TLR4、MR,且ΔA146Ply处理不影响其表面TLR4和MR的表达;ΔA146Ply处理后,凋亡的KG-1和C1498细胞显著增加（p<0.001,p<0.001）。2.ΔA146Ply抑制KG-1、C1498细胞自噬:ΔA146Ply处理后,KG-1和C1498细胞内抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤基因-2（B cell lymphoma 2,BCL-2）表达增加,培养上清中TNF-α的含量不增加;ΔA146Ply处理后,KG-1和C1498细胞内p62的水平增加,且LC3斑点减少。3.ΔA146Ply通过激活m TOR信号抑制KG-1、C1498细胞自噬:ΔA146Ply处理后KG-1、C1498细胞内Akt、ERK、m TOR的磷酸化水平增加;Akt的小分子抑制剂MK2206和ERK的小分子抑制剂U0126预处理KG-1、C1498细胞后,ΔA146Ply不能使KG-1、C1498细胞内m TOR的磷酸化水平、p62的水平增加。4.ΔA146Ply通过抑制自噬诱导KG-1、C1498细胞凋亡:Akt的小分子抑制剂MK2206和ERK的小分子抑制剂U0126预处理KG-1、C1498细胞后,ΔA146Ply不能诱导胞内裂解的胱天蛋白酶3（Cleaved caspase 3,CC3）的水平增加;同时ΔA146Ply不能诱导KG-1、C1498细胞凋亡。5.ΔA146Ply联合其他自噬抑制剂协同发挥抗白血病效应:ΔA146Ply联合氯喹（chlorquine,CQ）后,协同抑制KG-1、C1498细胞增殖,诱导其凋亡;ΔA146Ply联合BBM或CQ后,协同抑制THP-1、Raw264.7、K562细胞增殖,诱导其凋亡。6.ΔA146Ply联合CQ协同抑制KG-1、C1498细胞自噬:ΔA146Ply联合CQ处理KG-1、C1498细胞后,胞内Akt、ERK的磷酸化水平以及LC3、p62的水平均高于单独的ΔA146Ply或CQ组。结论:本部分研究证实了ΔA146Ply可通过激活m TOR信号抑制KG-1、C1498细胞自噬,诱导其凋亡。ΔA146Ply联合自噬抑制剂CQ后可协同抑制KG-1、C1498细胞自噬,进而抑制其增殖,诱导其凋亡。ΔA146Ply联合CQ或其他自噬抑制剂BBM后可协同抑制THP-1、Raw264.7、K562细胞增殖,诱导其凋亡。本部分研究为急性髓系白血病的辅助治疗提供了新的选择。总之,本研究证实了ΔA146Ply抑制三阴性乳腺癌细胞迁移、侵袭,诱导急性髓系白血病细胞凋亡的分子机制,为MR下游信号通路提供了新的理论与实验依据,同时为开发以ΔA146Ply为对象的抗肿瘤药物提供了有价值的实验依据。