背景:原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全球癌症发病第六位,死亡率居全球癌症死亡第四位,而中国肝癌新发病例和死亡病例数约占全球总数的50%以上[1]。在癌症总体发病率和死亡率呈下降趋势的情况下,肝癌的发病率仍以每年2%-3%的增速增长[2]。肝炎病毒感染、过量摄入酒精,黄曲霉毒素等是肝癌发生的高危因素。我国肝癌患者中,约90%为慢性乙型肝炎病毒（Chronic Hepatitis B virus,CHB）感染,因此HBV感染仍是我国肝癌最主要的病因。由于肝癌恶性程度高、较早发生转移,5年生存率在5%-30%之间。目前肝细胞癌的治疗仍是一个医学难题,尤其是对于没有显著血管浸润,局部淋巴结或远端转移的早期肝细胞肝癌病人。因此,深入研究肝细胞肝癌发生发展过程中的具体分子事件,有望为肝癌的早期诊断和治疗提供理论依据以及新的治疗策略。在肝癌的发病过程中往往伴随肝细胞炎症,纤维化和肝细胞异常再生,增生性结节形成过程中遗传变异不断积累,为发育异常的细胞提供增殖、侵袭和生存优势,最终导致肝癌的发生[3]。基因突变及其表达调控的改变与HCC的发生发展有着重要联系,高通量的下一代测序技术解析了HCC的突变图谱,目前已报道的与人类肝癌发生密切相关的驱动基因主要包括TERT、TP53、CTNNB1、NRAS、ARID1A和AXIN1等,对于鉴定HCC中具有抑癌或促癌功能的癌症驱动基因起到了极大的推动作用（表1）。TERT启动子区突变,HBV病毒基因组插入TERT启动子区,染色体易位和基因扩增等导致端粒酶激活是最常见的遗传变异,其突变频率达60%[4]。在30%-50%的HCC样本中发现了编码β-catenin的基因CTNNB1的突变,以及Wnt通路抑制剂AXIN1或APC失活,导致Wnt-β-catenin信号通路激活[5]。其他如TP53,RB1,PTEN,CCNA2,CCNE1,ARID1A基因突变或遗传变异等导致肝癌细胞周期调控异常。ARID1A,ARID2,KMT2家族基因突变引起表观修饰的改变[6,7]。FGF3,FGF4和FGF19基因扩增,TSC1,TSC2和PTEN的失活突变激活AKT-m TOR-MAPK信号通路。NFE2L2,KEAP1突变激活氧化应激途径[8,9]。此外,CCND1,FGF19,VEGFA,MYC和MET基因扩增导致多种致癌信号途径（包括受体酪氨酸激酶）的激活[10]。总体而言,每个HCC患者约含有50个基因组异常改变,其中约20%-25%的HCC患者含有一种以上的致癌突变。根据不同的转录图谱和组织学表型,特定的驱动基因突变可以对HCC进行分子分型[11-13]。由于肝癌的高度异质性,目前仍有必要深入研究HCC发病过程中的相关驱动事件,进一步阐明其在HCC发生发展过程中的作用及具体分子机制。课题组前期对临床HBV相关肝细胞癌队列进行了全外显子测序（whole-exome sequencing,WES）和转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）。通过聚类算法分析,筛选出四个枢纽基因:VPS35,SH3BP4,PPP1R12C和PNO1,与肝癌中已报道的致癌突变存在重叠的功能簇,提示其在肿瘤中的恶性生物学行为,有可能成为新的肿瘤相关基因。通过细胞功能学实验我们发现过表达VPS35在体外显著促进肝癌细胞增殖。囊泡蛋白分选相关蛋白35（Vacuolar Protein Sorting-Associated Protein 35,VPS35）是retromer复合物的关键组分。VPS35的C端与VPS29结合,N端与VPS26结合形成异源三聚体,即货物识别复合物（Cargo recognition complex,CRC）,主要功能是识别并结合细胞内的货物蛋白。CRC复合物与分选连接蛋白（Sorting nexin,SNX）形成的异二聚体一起,构成retromer复合物。最初在酵母中发现retromer复合物介导羧肽酶受体从内体转运至高尔基体[14]。Retromer作为内体蛋白分选机制的重要组成成分,介导货物蛋白从内体转运至高尔基体或直接从内体转运至细胞膜表面（图1）,其功能异常参与神经退行性疾病的发病。通过介导细胞膜上多种货物蛋白的分选,retromer复合物的功能与细胞内重要的生理过程如溶酶体起源、自噬、信号受体的调节和细胞扩散等密切相关。此外,retromer通过调控信号受体的转运和回收,参与了细胞内信号通路的调控,如β2-肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）[15],甲状旁腺素受体（Parathyroid hormone receptor,PTHR）[16-18]和干扰素受体2（Interferon receptor 2,IFNAR2）[19]等。VPS35与N-Ras相互作用,促进黑素瘤细胞的增殖,沉默VPS35下调丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号,抑制黑素瘤细胞增殖[20,21]。目前VPS35在肝细胞癌和癌旁组织中的表达水平及其在肝癌发生发展过程中的作用和具体机制尚未见相关文献报道。课题组前期通过对临床肝癌组织和癌旁组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法筛选枢纽基因,这些枢纽基因可能在HCC中发挥关键作用,因此可能成为功能研究的候选基因。联合细胞功能学鉴定我们筛选出潜在的肝癌驱动相关新基因VPS35,在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝癌中的致癌作用和调控的关键信号通路。在体内外实验中,我们首先明确了VPS35在临床肝癌样本中的表达水平,证实过表达VPS35促进肝癌细胞增殖,进一步对VPS35敲除的肝癌细胞进行RNA-Seq测序,研究其发挥促癌效应的具体分子机制。本研究在临床HCC队列中鉴定了潜在的HCC候选基因,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。实验方法:1.鉴定潜在的肝癌驱动基因。首先通过图表聚类算法筛选可能在HCC中发挥关键作用的枢纽基因。然后通过细胞功能学验证筛选出潜在的肝癌驱动基因VPS35。利用TCGA数据库资料对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝细胞癌中的致癌作用和调控的关键信号途径。进一步明确VPS35在肝癌组织中的表达情况。通过TCGA数据库分析VPS35在肝癌组织中的表达及与预后的关系。采用Real-time PCR,Western blot和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）的方法检测VPS35在临床肝癌和癌旁组织中的表达情况。通过Western blot,Real-time PCR实验以及分析TCGA数据库资料从HBV感染、转录因子调控和DNA甲基化三个方面探讨VPS35在肝癌组织中表达上调的机制。2.通过体外细胞功能学实验观察VPS35对肝癌细胞系增殖能力和细胞周期的影响。利用Ad Easy腺病毒载体系统构建过表达VPS35的重组腺病毒表达载体,获得过表达VPS35的肝癌细胞模型;利用CRISPR/Cas9技术构建VPS35特异性敲除的肝癌细胞模型。通过MTS实验、克隆形成实验和Ed U细胞增殖检测观察VPS35对肝癌细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术和Western blot实验观察VPS35对肝癌细胞的细胞周期的调控作用;在裸鼠皮下移植瘤模型中观察VPS35基因敲除对肿瘤生长的影响:皮下注射VPS35敲除的肝癌细胞,观察VPS35敲除对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力变化,验证体外实验结果。3.检测VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控。对VPS35敲除的肝癌细胞和对照Parental细胞进行转录组测序,对差异表达基因进行通路富集分析,发现这些差异基因主要富集在溶酶体和PI3K/AKT信号通路。通过Real-time PCR在m RNA水平验证VPS35过表达和基因敲除对PI3K/AKT和RAS信号通路相关分子的调控。采用Western blot在蛋白水平验证VPS35过表达和基因敲除对AKT信号活化的影响。采用AKT抑制剂MK2206处理后,通过MTS和克隆形成实验观察MK2206对肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术和Western blot实验观察MK2206对肝癌细胞周期的影响。在裸鼠原位移植瘤模型中观察过表达VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控:肝脏原位注射VPS35过表达的肝癌细胞,设置MK2206处理组,观察过表达VPS35对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Western blot和IHC染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化,观察MK2206是否可以逆转VPS35的致癌效应,验证体外实验结果。4.探索VPS35激活PI3K/AKT信号的具体机制。通过TCGA数据库HCC队列资料进行相关性分析,发现VPS35表达与RTK家族成员（FGFR3,FGFR3,和NTRK1）呈正相关。通过流式细胞术,Western blot和免疫荧光实验检测VPS35敲除后细胞膜上RTKs表达水平。进一步在VPS35敲除肝癌细胞中重新过表达VPS35,通过Western blot和免疫荧光实验观察回复VPS35是否可以调控细胞膜上FGFR3的表达。结果:1.运用图表聚类算法对发生转录的238个突变等位基因进行蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络分析和基因本体论（Gene ontology,GO）分析,挖掘潜在的肝癌相关新基因。联合MTS和克隆形成实验在体外进行验证,我们筛选出肝癌相关新基因VPS35。通过TCGA数据库分析发现VPS35在肝癌组织中的表达显著上调（P<0.05）。Real-time PCR、Western blot和免疫组化染色检测结果显示与癌旁组织相比,肿瘤组织中VPS35表达水平明显上调。VPS35在肝癌组织中表达上调的机制探讨:HBV感染对VPS35表达水平无明显影响;两个重要的转录因子TBP和TCF3与VPS35的表达成正相关,Real-time PCR实验提示肿瘤组织中TBP和VPS35均表达上调,TCF3表达水平无明显变化;Meth HC DNA甲基化数据库分析显示肝癌组织内（n=204）VPS35启动子甲基化水平显著降低（P=0.037）,因此,基于转录水平和表观修饰的调控可能均参与了VPS35在肝癌组织中的高表达。VPS35与PI3K/AKT信号通路相关基因的体细胞突变互相协同,如FGFR3（P=0.05）。在TCGA数据库中,体细胞VPS35突变或表达上调均与肝癌预后不良相关,提示VPS35在肝癌中的恶性生物学效应。2.VPS35过表达显著促进肝癌细胞增殖能力和肝癌细胞周期G1/S期转换和细胞周期进程;而敲除VPS35显著抑制肝癌细胞增殖,肝癌细胞周期阻滞于G1期。裸鼠皮下移植瘤实验显示VPS35基因敲除显著抑制肿瘤生长。3.RNA-Seq结果显示差异基因主要富集在PI3K/AKT信号通路中,Real-time PCR和Western blot实验验证了过表达VPS35激活RAS和PI3K/AKT信号,VPS35敲除抑制PI3K/AKT信号活化。AKT抑制剂MK2206在体内外可逆转VPS35促肝癌细胞生长和细胞周期进程效应。4.VPS35敲除后肝癌细胞FGFR3染色阳性的细胞百分比显著减少,细胞膜成分中FGFR3表达显著下调。而在VPS35敲除细胞中过表达VPS35可以回复细胞膜上FGFR3的表达水平,提示FGFR3在细胞内的回收增多和（或）溶酶体降解减少,从而激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞增殖。结论:课题组前期通过对临床肝癌组织和匹配的癌旁硬化组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法和细胞功能学验证,我们鉴定了一个潜在的肝癌驱动候选基因VPS35。VPS35在肝癌组织的表达明显高于癌旁组织,体内外实验中均证明VPS35通过促进肝癌细胞周期G1/S期转换促进肝癌细胞增殖。研究其机制发现:VPS35作为retromer复合物的关键组分,通过介导细胞膜表面FGFR3受体的循环,激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞G1期到S期转换和细胞周期进程,促进肝癌细胞增殖;而AKT抑制剂MK2206可逆转VPS35的致癌效应。本课题阐释了VPS35通过激活PI3K/AKT信号促进肝癌增殖的具体分子机制,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。