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[目的]1、通过检测乳腺癌发生不同阶段中ER81的表达,探讨ER81转录因子在乳腺癌发生中的作用。2、研究人ER81基因的特异的RNAi表达体系是否抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞系中ER81的表达,促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡,为乳腺癌的治疗提供新的途径。[方法]1、采用免疫组织化学EnVision法检测20例正常乳腺组织、21例乳腺普通型导管增生、20例乳腺非典型性导管增生、20例乳腺导管原位癌和89例乳腺浸润性导管癌组织中ER81蛋白表达。2、在本实验室先前的工作中,我们针对人ER81 mRNA序列,筛选、设计、合成siRNA基因片段,构建特异的siRNA表达载体pGenesill-ER81A-siRNA、ER81B-siRNA、ER81C-siRNA,以乱序siRNA表达载体和空载体作为对照,脂质体法基因转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,建立了5个稳定转染的细胞系,即:pGenesil-ER81A-siRNA重组质粒转染组(A组)、pGenesil-ER81B-siRNA重组质粒转染组(B组)、pGenesil-ER81C-siRNA重组质粒组(C组)、乱序siRNA重组质粒转染组(Scrambled-siRNA group,SS组)、空载体转染组(empty vector group,EV组)。在本实验中,我们以上述5个稳定转染的MDA-MB-231细胞系及未转染的MDA-MB-231细胞系(untransfected group,UT组)为对象,实时荧光定量PCR检测各组MDA-MB-231细胞的ER81 mRNA表达水平并观察ER81 mRNA的表达是否受到抑制,应用MTT比色分析法、平板克隆形成实验和流式细胞技术观察siRNA阻断ER81基因表达对MDA-MB-231细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期分布及细胞凋亡的影响。[结果]1、正常乳腺组织、乳腺普通型导管增生、乳腺非典型性导管增生、乳腺导管原位癌和乳腺浸润性导管癌中ER81阳性表达率分别为0.0%(0/20)、9.5%(2/21)、15.0%(3/20)、30.0%(6/20)和42.7%(38/89)。统计学分析显示,五组比较总体上有统计学差异(P＜0.01),两两比较结果:乳腺正常组织与乳腺普通性增生比较无统计学差异(P=0.488),乳腺正常组织与乳腺原位癌比较有统计学差异(P=0.020);乳腺普通性增生与乳腺浸润癌比较有统计学差异(P=0.005);乳腺非典型增生与乳腺浸润癌比较有统计学差异(P=0.023);乳腺原位癌与乳腺浸润癌比较无统计学差异(P=0.326);2、实时荧光定量PCR检测6组MDA-MB-231细胞ER81基因mRNA表达,结果显示A组和C组ER81 mRNA表达水平较UT组分别下降了72.6%和65.8%,其间差异有统计学意义(P＜0.05);B组ER81 mRNA表达较UT组降低了34.0%,但统计学分析无差异(P＞0.05)。3、MTT比色分析法结果显示,A、C组接种3天后,吸光度与UT组、SS组及EV组比较显著降低(P＜0.01);B组接种5天后,吸光度较对照组降低(P＜0.05);接种4天后A、C组吸光度较B组降低(P＜0.05);表明A、B、C组肿瘤细胞均有明显的生长抑制,其中以A、C组肿瘤细胞的生长抑制为明显。4、平板克隆形成实验结果显示A组、C组接种250、500个细胞后形成的克隆数较UT组、SS组、EV组和B组明显减少(P＜0.01),克隆形成率亦小于对照组和B组(P＜0.01);B组克隆形成率小于对照组(P＜0.01);5、流式细胞技术检测:①细胞周期分析结果显示A、C组G0/G1期细胞比例较UT组、SS组、EV组和B组增高,S期和G2/M期细胞比例降低(P＜0.01),细胞的增殖指数明显降低,其间差异有统计学意义(P＜0.01)。②A组、C组肿瘤细胞凋亡率高于UT组、SS组、EV组和B组(P＜0.05),而B组凋亡率高于UT组、SS组和EV组(P＜0.05)。[结论]1、ER81转录因子表达出现在乳腺癌发生的早期阶段(普通型增生和非典型增生),且阳性表达率随病变的升级逐渐增加,提示ER81基因在乳腺癌的发生过程中起着重要作用;2、三组siRNA经脂质体法稳定转染MDA-MB-231细胞能显著地发挥基因沉默效应,抑制ER81 mRNA的转录水平,使细胞增殖能力降低,生长受到抑制,肿瘤细胞发生G0/G1期部分阻滞,细胞增殖指数降低,细胞凋亡率明显提高,其中以A组、C组基因沉默效应更为显著。3、针对人ER81基因的特异RNAi表达体系有望成为乳腺癌基因治疗的新途径。