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猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS),俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种以母猪流产、早产、产木乃伊胎儿和仔猪呼吸道症状及死亡为特征的传染病。该病自上世纪出现以来,给世界养猪业造成了严重的经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。对蓝耳病的诊断和预防一直是研究热点。本研究旨在建立一种高致病性蓝耳病的分子诊断方法,探讨研制核酸疫苗的可行性,取得了如下初步结果。1.用Marc-145细胞分离了高致病性蓝耳病病毒甘肃株(GS株),对其基因全序列进行了测定,利用生物信息学软件对其结构蛋白进行了分析,并对其抗原表位做了预测。2.通过序列分析设计合成了3条特异性引物,运用一步法RT-PCR,初步建立了高致病性蓝耳病病毒的分子诊断方法,试验结果显示,该法具有快速、特异和敏感等特点,可用于临床样品的快速检测。3.以ORF3和ORF5抗原基因作为核酸疫苗研究的目的基因,用pBudCE4.1载体构建了真核表达载体pBud-GP3和pBud-GP5。用脂质体法将pBud-GP3和pBud-GP5分别转染Marc-145细胞,通过RT-PCR和荧光抗体检测,目的基因在Marc-145细胞中获得了表达;以BALB/c小鼠为动物模型,通过肌肉注射重组质粒进行免疫接种,用间接ELISA检测抗PRRSV抗体。结果显示,pBud-GP3和pBud-GP5能够有效诱导机体产生体液免疫,说明ORF3和ORF5抗原基因作为PRRSV核酸疫苗的候选基因是可行的。4.选用IFN-γ基因作分子佐剂,构建了pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5重组质粒。将pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5质粒转染Marc-145细胞,通过RT-PCR和荧光抗体检测重组质粒在体外的表达情况。然后通过肌肉接种免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测免疫抗体水平;流式细胞术检测T淋巴细胞亚型。结果显示:pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5重组质粒可增强小鼠细胞免疫应答,IFN-γ发挥了免疫佐剂的作用,增强了DNA疫苗的免疫原性,是一种很良好的免疫佐剂。同时,为了研究CD58分子作为免疫佐剂的可行性,构建了pBud-CD-GP3和pBud-CD-GP5重组质粒。将pBud-CD-GP3和pBud-CD-GP5重组质粒分别转染Marc-145细胞,RT-PCR和荧光抗体检测结果表明,CD58分子、GP3和GP5在体外获得了表达。为进一步通过动物模型来研究CD58分子的免疫作用奠定了基础。