论文部分内容阅读
本研究探讨竹节香附素A对人肝癌HepG2细胞增殖抑制作用及其作用机制,具体包括以下两个方面。一、竹节香附素A对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响目的:探讨竹节香附素A在体外对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法:应用四氮唑盐比色法(MTT法)、平板克隆形成实验检测竹节香附素A对人肝癌细胞HepG2增殖的影响;应用混合荧光染色吖碇橙/嗅乙碇(AO/EB)法、DNA梯度电泳法检测竹节香附素A对HepG2细胞凋亡的影响;结果:(1)竹节香附素A明显抑制人肝癌细胞HepG2的生长与增殖,半数抑制浓度(IC50)为8.94μg/mL;用不同剂量组即5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL的竹节香附素A与HepG2细胞共培养72h,在培养24h时的细胞增殖抑制率分别为:(24.81±0.55)%、(39.17±1.30)%、(62.45±7.56)%、(79.93±5.48)%;在培养48h时的抑制率为:(35.67±0.81)%、(49.73±9.18)%、(71.62±1.03)%、(87.06±1.84)%;在培养48h时的抑制率为:(42.52±1.31)%、(59.75±7.47)%、(78.85±3.15)%、(91.36±0.84)%;竹节香附素A各剂量组与未处理组相比,各时间点均有显著性差异(P<0.001);集落形成实验显示:对照组的集落形成率为45.47%,而竹节香附素A 1.25、2.5、5μg/mL 3个剂量组仅分别为15.73%、7.2%和3.33%,即集落形成抑制率分别为(66.75±1.66)%、(84.25±3.11)%、(92.55±2.33)%,与对照组相比有显著性差异(P<0.001)。(2)竹节香附素A能诱导HepG2细胞的凋亡,且随着作用时间的延长,效应逐渐明显。结论:(1)首先发现竹节香附素A对人肝癌细胞HepG2生长增殖具有明显抑制作用。并随着剂量加大及作用时间延长这种抑制作用会进一步加强,呈剂量-时间依赖性。(2)竹节香附素A具有强效、快速的抗肿瘤活性,具有潜在的药用价值。(3)竹节香附素A具有诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用。二、竹节香附素A对人肝癌HepG2细胞HIF-α和VEGF基因表达的影响目的:探讨竹节香附素A对HepG2细胞血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)和缺氧诱导因子(hypoxia - inducible factor-1α)基因表达的影响。方法:应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同浓度竹节香附素A处理HepG2细胞24h后上清液中VEGF蛋白表达的变化;应用RT-PCR检测竹节香附素A对HepG2细胞VEGF和HIF-1α基因mRNA表达的影响;应用蛋白免疫印迹法(western-blot)检测竹节香附素A对HepG2细胞VEGF和HIF-1α蛋白表达的影响。结果:(1)竹节香附素A(5、10、20μg/mL)分别处理HepG2细胞24h后细胞培养上清液中VEGF呈剂量依赖性减少(P=0.000);(2)竹节香附素A对HepG2细胞HIF-1α和VEGFmRNA的表达影响。①不同浓度竹节香附素A(0、5、10、20μg/mL)处理HepG2细胞24h后,HIF-1α和VEGFmRNA的表达水平减少,HIF-1α阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(0.65±0.07)、(0.43±0.08)、(0.19±0.03)、(0.08±0.02),(P=0.000);VEGF阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(0.96±0.07)、(0.75±0.09)、(0.55±0.10)、(0.32±0.11),(P=0.000)。②10μg/mL竹节香附素A分别处理HepG2细胞0h、6h、12h、24h后,HIF-1α和VEGF mRNA的表达水平亦下降,HIF-1α阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(0.73±0.08)、(0.44±0.12)、(0.24±0.09)、(0.07±0.03),(P=0.000);VEGF阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(0.77±0.05)、(0.53±0.09)、(0.32±0.12)、(0.15±0.04),(P=0.000)。(3)竹节香附素A抑制HepG2细胞HIF-1α和VEGF蛋白的表达。①不同浓度竹节香附素A(0、5、10、20μg/mL)处理HepG2细胞24h后,结果未用药组可见强表达,药物组HIF-1α和VEGF蛋白表达下降,并随着药物剂量的增加其表达进一步下降。HIF-1α阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(0.84±0.08)、(0.39±0.06)、(0.28±0.04)、(0.08±0.03),(P=0.000);VEGF阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(2.08±0.28)、(1.43±0.22)、(0.72±0.15)、(0.17±0.10),(P=0.000)。②10μg/mL竹节香附素A分别处理HepG2细胞0h、6h、12h、24h后HIF-1α和VEGF蛋白的表达逐渐减少。未用药组可见强表达,随着随药物作用时间的延长,HIF-1α和VEGF表达减少,HIF-1α阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(2.31±0.33)、(1.70±0.17)、(1.30±0.96)、(0.09±0.13),( P=0.000);VEGF阳性条带灰度值与β-actin比值分别为(2.47±0.05)、(1.36±0.02)、(0.30±0.02)、(0.07±0.02),(P=0.000)。结论:(1)竹节香附素A在体外具有够抑制肝癌HepG2细胞分泌VEGF蛋白的作用。(2)竹节香附素A能够抑制HepG2细胞HIF-1α和VEGF的mRNA表达,并呈时间-剂量依赖性。(3)竹节香附素A具有抑制HepG2细胞HIF-1α和VEGF的蛋白表达的作用,且呈时间-剂量依赖性。(4)抑制肿瘤细胞新生血管形成,可能是竹节香附素A抑制肝癌细胞生长增殖的重要机制之一。