论文部分内容阅读
刺梨(Rose roxburghii Tratt)又名文先果、送春归，是蔷薇科蔷薇属落叶灌木，主要生长于我国西南山区，特别在贵州地区分布最为广泛。刺梨果实富含黄酮、多糖、维生素、超氧化物歧化酶和有机酸等营养元素，传统医学也用于治疗糖尿病、癌症、积食腹胀、高血脂、高血压和维生素C缺乏症等，是一种典型的药食同源的水果。多糖作为刺梨最主要的活性成分之一，但目前关于刺梨多糖的结构特征、降血糖活性、作用机理和构效关系尚不清楚。本论文选择刺梨果为实验原料，首先研究了刺梨多糖的提取、分离纯化、理化性质和结构特征；其次，通过体外化学实验、细胞实验和动物实验相结合，深入探究了刺梨多糖的降血糖活性和对肠道微生物的影响；最后，将一种纯化的刺梨多糖(RTFP-3)作为表面修饰剂和调控剂，成功制备出刺梨多糖纳米硒复合物(RP3-SeNPs)，研究了其对氧化损伤大鼠胰岛瘤(INS-1)细胞的保护作用和机理，可开发成一种新型的硒补充剂，应用于糖尿病的治疗。主要研究结果如下：
(1)采用热水浸提法从刺梨果中提取刺梨粗多糖，命名为RTFP，经阴离子交换柱层析分离纯化得到四个组分，分别命名为RTFP-1、RTFP-2、RTFP-3和RTFP-4，其中RTFP-1和RTFP-3得率最高，分别占RTFP的12.30%和23.84%(w/w)。高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析表明RTFP-1和RTFP-3的平均分子量大小分别为128.7和67.2kDa；甲基化和1D/2DNMR分析表明，RTFP-1主要由→5)-α-L-Araf-(1→、→6)-α-D-Galp-(1→、→3)-α-D-GalpNAc-(1→、→4)-β-D-GalpA-(1→、β-D-Xylp-(1→和α-D-Glcp-(1→等糖苷键组成；RTFP-3主要由→6)-α-D-Galp-(1→、→4)-α-D-GalpA-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、→3,4)-β-L-Fucp-(1→、→4)-β-D-Glcp-(1→和β-D-Glcp-(1→等糖苷键组成。
(2)采用体外化学和细胞实验评价刺梨多糖的降血糖活性，结果表明RTFP-1和RTFP-3均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其半数抑制浓度(IC50)值分别为2.04和4.15mg/mL，且二者均属于混合型抑制类型。RTFP-1和RTFP-3存在时，酶-抑制剂解离常数Ki值分别为5.104和19.889mg/mL，酶-抑制剂-底物解离常数Kis值分别为0.421和7.007mg/mL。RTFP-1和RTFP-3对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭类型属于静态猝灭，两者与α-葡萄糖苷酶之间的结合位点数分别为1.04和1.44。细胞实验结果表明，RTFP-3可显著提高胰岛素抵抗HepG2(IR-HepG2)细胞的葡萄糖吸收能力、丙酮酸激酶与己糖激酶的活性，下调葡萄糖6磷酸酶mRNA表达量，促进IR-HepG2细胞对葡萄糖的摄取和肝糖原的合成。
(3)以刺梨多糖RTFP-3(2 mg/mL)作为调控剂，采用单步绿色原位合成方法，制备得到稳定均一的刺梨多糖纳米硒(RP3-SeNPs)溶液，平均粒径为104.5nm；RP3-SeNPs能够有效降低氧化损伤INS-1细胞内活性氧(ROS)的产生和细胞内线粒体跨膜电位ΔΨm下降，抑制细胞内caspase-3，caspases-8和caspsae-9的过度激活，以及下调解偶联蛋白-2(UCP-2)的蛋白表达。结果表明RP3-SeNPs能够抑制H2O2诱导的INS-1细胞凋亡，保护INS-1细胞的正常功能。
(4)通过体外模拟口腔、胃部、小肠和大肠消化实验，研究刺梨多糖RTFP-3在消化过程中的变化，结果发现唾液淀粉酶对刺梨多糖RTFP-3的相对分子质量无影响，在模拟胃、小肠消化体系中，多糖的相对分子质量发生改变，从67.59kDa降低为44.22kDa，还原糖含量从0.503mM增加为1.744mM，但是在整个模拟消化过程中，没有检测到游离单糖；在模拟大肠消化酵解阶段，经过48h酵解，RTFP-3使酵解液中的总短链脂肪酸含量从23.49mM增加到44.29mM。此外，RTFP-3还可以改变肠道微生物的群落组成，RTFP-3使微生物组成中厚壁菌门和拟杆菌门的比值从14.89降低到4.68，提高肠道中有益菌的丰度。
(5)以自发性糖尿病db/db小鼠为模型，膳食干预8周后，结果表明，RTFP可以显著降低db/db小鼠的体重、空腹血糖、空腹胰岛素和高血脂症状，RTFP还可以下调模型组小鼠肝脏中糖异生和脂肪生成关键基因的表达水平(如G6Pase、FAS、ACC-1、SREBP-1c和PPAR-γ)，降低小鼠肝脏组织中脂肪的堆积；采用16SrRNA基因测序技术对不同处理组小鼠的肠道微生物组成和生物多样性进行分析，RTFP的干预不仅逆转了糖尿病小鼠肠道内的厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度的比值，而且提高了小鼠肠道中Bacteroidaceae、Bacteroidaceae_S24-7_group和Lactobacillaceae等有益菌的丰度，降低了Enterocaccaceae、Desulfovibrionaceae等有害菌的丰度。
(1)采用热水浸提法从刺梨果中提取刺梨粗多糖，命名为RTFP，经阴离子交换柱层析分离纯化得到四个组分，分别命名为RTFP-1、RTFP-2、RTFP-3和RTFP-4，其中RTFP-1和RTFP-3得率最高，分别占RTFP的12.30%和23.84%(w/w)。高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析表明RTFP-1和RTFP-3的平均分子量大小分别为128.7和67.2kDa；甲基化和1D/2DNMR分析表明，RTFP-1主要由→5)-α-L-Araf-(1→、→6)-α-D-Galp-(1→、→3)-α-D-GalpNAc-(1→、→4)-β-D-GalpA-(1→、β-D-Xylp-(1→和α-D-Glcp-(1→等糖苷键组成；RTFP-3主要由→6)-α-D-Galp-(1→、→4)-α-D-GalpA-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、→3,4)-β-L-Fucp-(1→、→4)-β-D-Glcp-(1→和β-D-Glcp-(1→等糖苷键组成。
(2)采用体外化学和细胞实验评价刺梨多糖的降血糖活性，结果表明RTFP-1和RTFP-3均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其半数抑制浓度(IC50)值分别为2.04和4.15mg/mL，且二者均属于混合型抑制类型。RTFP-1和RTFP-3存在时，酶-抑制剂解离常数Ki值分别为5.104和19.889mg/mL，酶-抑制剂-底物解离常数Kis值分别为0.421和7.007mg/mL。RTFP-1和RTFP-3对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭类型属于静态猝灭，两者与α-葡萄糖苷酶之间的结合位点数分别为1.04和1.44。细胞实验结果表明，RTFP-3可显著提高胰岛素抵抗HepG2(IR-HepG2)细胞的葡萄糖吸收能力、丙酮酸激酶与己糖激酶的活性，下调葡萄糖6磷酸酶mRNA表达量，促进IR-HepG2细胞对葡萄糖的摄取和肝糖原的合成。
(3)以刺梨多糖RTFP-3(2 mg/mL)作为调控剂，采用单步绿色原位合成方法，制备得到稳定均一的刺梨多糖纳米硒(RP3-SeNPs)溶液，平均粒径为104.5nm；RP3-SeNPs能够有效降低氧化损伤INS-1细胞内活性氧(ROS)的产生和细胞内线粒体跨膜电位ΔΨm下降，抑制细胞内caspase-3，caspases-8和caspsae-9的过度激活，以及下调解偶联蛋白-2(UCP-2)的蛋白表达。结果表明RP3-SeNPs能够抑制H2O2诱导的INS-1细胞凋亡，保护INS-1细胞的正常功能。
(4)通过体外模拟口腔、胃部、小肠和大肠消化实验，研究刺梨多糖RTFP-3在消化过程中的变化，结果发现唾液淀粉酶对刺梨多糖RTFP-3的相对分子质量无影响，在模拟胃、小肠消化体系中，多糖的相对分子质量发生改变，从67.59kDa降低为44.22kDa，还原糖含量从0.503mM增加为1.744mM，但是在整个模拟消化过程中，没有检测到游离单糖；在模拟大肠消化酵解阶段，经过48h酵解，RTFP-3使酵解液中的总短链脂肪酸含量从23.49mM增加到44.29mM。此外，RTFP-3还可以改变肠道微生物的群落组成，RTFP-3使微生物组成中厚壁菌门和拟杆菌门的比值从14.89降低到4.68，提高肠道中有益菌的丰度。
(5)以自发性糖尿病db/db小鼠为模型，膳食干预8周后，结果表明，RTFP可以显著降低db/db小鼠的体重、空腹血糖、空腹胰岛素和高血脂症状，RTFP还可以下调模型组小鼠肝脏中糖异生和脂肪生成关键基因的表达水平(如G6Pase、FAS、ACC-1、SREBP-1c和PPAR-γ)，降低小鼠肝脏组织中脂肪的堆积；采用16SrRNA基因测序技术对不同处理组小鼠的肠道微生物组成和生物多样性进行分析，RTFP的干预不仅逆转了糖尿病小鼠肠道内的厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度的比值，而且提高了小鼠肠道中Bacteroidaceae、Bacteroidaceae_S24-7_group和Lactobacillaceae等有益菌的丰度，降低了Enterocaccaceae、Desulfovibrionaceae等有害菌的丰度。