论文部分内容阅读
猪圆环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起的相关疾病已对全球养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2为单链闭合环状DNA病毒,基因组结构紧凑,包含数个开放阅读框（Open reading frames,ORFs）,其中ORF1和ORF2与病毒复制及组装关系密切:ORF1编码两个与复制相关的蛋白质（Rep和Rep’）;ORF2编码病毒唯一的衣壳蛋白（Capsid protein,Cap）,是PCV2的主要抗原蛋白。核定位信号肽（Nuclear localization signal,NLS）位于Cap蛋白质的N端,由N端前41位富含带正电荷的碱性氨基酸残基组成。2018年,Wanting Yu等报道PCV2 Cap蛋白N端NLS具有细胞穿梭肽的功能,且其前17个氨基酸残基（NLS-A）在该功能中起关键作用[40]。PCV2 Cap蛋白N端NLS-A区含有两个相对保守的芳香族氨基酸残基,即第三位的酪氨酸残基（tyrosine,Y）和第八位的苯丙氨酸残基（phenylalanine,F）或者Y。尚未有研究报道NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基对NLS-A的功能及PCV2复制能力的影响。本课题以近年来最流行的PCV2d毒株为研究对象,用丙氨酸残基（alanine,A）分别替代其NLS-A区第三位的~3Y和第八位的~8F。通过合成FITC-荧光标记NLS-A多肽（FITC-NLS-A）,进行流式细胞术分析,研究NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基对NLS-A入侵细胞功能的影响。同时,我们以PCV2d为亲本毒株,用A替代NLS-A区第三位的~3Y和第八位的~8F,构建PCV2感染性克隆,以其拯救病毒。通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）、Real-time PCR和TCID50检测PCV2的体外复制能力,研究NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基对PCV2复制能力的影响。从而对PCV2 Cap蛋白NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基的功能进行鉴定,为更进一步理解PCV2 Cap蛋白NLS的作用机制及PCV2复制增殖分子机制提供实验依据和理论基础。本研究获得了以下成果:（1）PCV2 Cap蛋白N端NLS-A区第八位的~8F突变成A（F8A）能显著或极显著降低NLS-A穿透细胞的能力（6μM时,为显著;20μM和40μM时,为极显著）;同时将NLS-A第三位的~3Y和第八位的~8F突变成A,可以极显著降低NLS-A穿透细胞的能力,且穿透能力远远低于NLS-A（F8A）突变体;NLS-A第三位的~3Y对NLS-A穿透细胞的能力的影响有浓度依赖性。（2）PCV2 Cap蛋白N端NLS-A区第三位的~3Y和第八位的~8F突变后,PCV2复制能力极显著下降（P<0.01）。用突变型和野生型的PCV2感染性克隆质粒分别转染PK15细胞,盲传十代。应用PCR和Real-time PCR技术对十代病毒悬液进行鉴定,结果表明突变型和野生型PCV2毒株均能在体外盲传十代以上,盲传至第五代的细胞IFA结果进一步佐证该结论。但各代突变型PCV2毒株的基因组拷贝数极显著低于野生型PCV2毒株的（P<0.01）:此外,用拯救的突变型和野生型PCV2毒株分别接种PK15细胞,对五代以内的病毒悬液进行TCID50测定,结果表明突变型PCV2毒株的病毒滴度极显著低于野生型PCV2毒株的（P<0.01）。综合以上结果可以发现,NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基突变后PCV2的复制能力极显著下降（P<0.01）,且这种结果可能是由于NLS-A穿透细胞的能力减弱导致的。（3）NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基对PCV2复制能力的影响无宿主细胞依赖性。用突变型和野生型的PCV2感染性克隆质粒分别转染J2细胞,盲传十代。应用Real-time PCR对十代病毒悬液进行鉴定,结果表明突变型PCV2毒株的基因组拷贝数极显著低于野生型PCV2毒株的（P<0.01）。该结果与以PK15为宿主细胞所得到的结论一致,表明NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基对PCV2复制能力的影响无宿主细胞依赖性。本研究对PCV2 Cap蛋白NLS-A区保守性芳香族氨基酸残基的功能进行了鉴定,为更进一步理解PCV2 Cap蛋白NLS的作用机制及PCV2复制增殖分子机制提供了实验依据和理论基础。