高效α-葡萄糖苷酶抑制能力益生菌的筛选及其胞外多糖的结构与功能研究

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近年来,肠道微生物对胃肠健康及某些代谢综合征的益生作用正逐渐被人们认可并广泛接受,被认为是“人体器官”之一。而乳酸菌作为人类肠道微生物的重要组成部分,具有安全性和高效性兼顾的特点,在食品、医药等领域有很大的应用价值。随着人们生活水平的提高,许多代谢综合征的发病率日益增长。二型糖尿病就是其中最常见也是危害最大的的代谢综合征之一,其病情主要特点为高血糖和胰岛素的相对缺乏。然而,目前关于乳酸菌调节血糖的物质基础研究还相对较少,乳酸菌在2型糖尿病中的应用前景还没有得到广泛的探索。因此,寻找天然高效的降血糖乳酸菌和降血糖代谢产物便成为当前重要的任务。抑制α-葡萄糖苷酶活性是控制血糖浓度的重要策略。本文以国内外食品来源的乳酸菌为筛选对象,通过建立α-葡萄糖苷酶体外筛选模型对菌株的菌悬液、灭活菌悬液、胞内提取物和胞外分泌物分别进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究,最终确定L.rhamnosus LB1lac10的胞外分泌物具有最高的α-葡萄糖苷酶抑制能力,并对该菌株的基因组进行全基因组测序及功能基因注释。为进一步确定L.rhamnosus LB1lac10降血糖能力的物质基础,对该菌的胞外多糖(EPS)进行了提取和纯化,并进一步鉴定了其抑制α-葡萄糖苷酶的能力,并通过刚果红试验、凝胶色谱(GPC)、高效液相色谱(HPLC)、紫外全波长扫描(UV)、红外光谱(FT-IR)、核磁共振(NMR)等方法,对其结构和组成进行解析。主要研究结果如下。(1)特色功能食品中乳酸菌的分离和鉴定。本实验利用传统的微生物分离纯化方法,结合现代分子生物学手段对国内外特色功能食品中的潜在乳酸菌进行分离和鉴定。根据实验中所分离菌株的表型特性和基于16S r DNA的Blast比对结果进行系统发育分析,将22株菌确定为12个菌种:8株鼠李糖乳杆菌、2株干酪乳杆菌、2株瑞士乳杆菌、2株植物乳杆菌、1株嗜酸乳杆菌、1株嗜热链球菌、1株活动乳杆菌、1株布式乳杆菌、1株短乳杆菌,1株戊糖乳杆菌,1株戊糖乳球菌,1株解淀粉乳酸杆菌。(2)建立α-葡萄糖苷酶体外筛选体系测定乳酸菌株的α-葡萄糖苷酶抑制能力。通过对乳酸菌的菌悬液、灭活菌悬液、胞外分泌物(CFS)和胞内提取物(CFE)的α-葡萄糖苷酶抑制能力测定,筛选到L.rhamnosus LB1lac10的CFS具有最强的抑制能力(27.74%),表明L.rhamnosus LB1lac10菌株可能是具有降低血糖能力的天然菌株。(3)利用第三代Nanopore测序技术对L.rhamnosus LB1lac10进行了全基因组测序,并进行了基因组功能注释。在基因组功能注释结果中,Nr数据库比对结果表明此菌株有97.15%的可能性是鼠李糖乳杆菌;在COG功能注释中发现,碳水化合物的运输和新陈代谢功能(Carbohydrate transport and metabolism)的相关基因相对较多;KEGG的代谢过程分析显示,ABC transporters(转运蛋白)、Carbon metabolism(碳代谢)的基因高度富集。此外,CAZy(碳水化合物活性酶数据库)比对结果显示,此菌株含有大量的糖苷水解酶和糖基转移酶,表明该菌株机体内的碳水化合物代谢活跃,特别是糖苷键的水解和糖基的转移过程。降血糖物质功能基因挖掘结果显示,该菌株具有8个与胞外多糖合成相关的功能基因,这些基于分子基础上的结论都在一定程度上对此菌株具有高效α-葡萄糖苷酶抑制能力做出了合理的解释。(4)胞外多糖EPS1-1的分离纯化与结构功能研究分析。对L.rhamnosus LB1lac10的胞外多糖(EPS)进行了粗提,粗胞外多糖EPS-1产量为8.24 g/L。通过分子筛层析对EPS-1进行纯化,将检测为单一组分的纯胞外多糖命名为EPS1-1。经检测,EPS1-1同样具有高效的α-葡萄糖苷酶体外抑制能力。凝胶色谱(GPC)和单糖组成测定结果显示L.rhamnosus LB1lac10的EPS1-1分子量为88650 Da,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。红外光谱(FT-IR)和核磁共振分析(NMR)结果表明,EPS1-1具有典型的多糖结构官能团,含有两种α-构型的糖苷键。主要糖苷键对应于→4)-α-D-Glcp-(1→。刚果红试验和热力学稳定性研究表明EPS1-1具有三股螺旋结构,并且具有较高的耐热性,可以达到热产品加工的要求。综上所述,本研究中的发现的L.rhamnosus LB1lac10,作为食品来源的乳酸菌,具有高效的α-葡萄糖苷酶抑制能力。其所产的胞外多糖EPS1-1同样具有明确的α-葡萄糖苷酶抑制功能。在将来它们可以作为一种天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂用于在日常饮食中调节血糖平衡。
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