【摘 要】
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目的:研究表明雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）通过增强骨髓源性免疫抑制细胞（Myeloid derived suppressed cells,MDSC）的免疫抑制功能,从而抑制角膜移植免疫排斥反应,但具体机制尚不完全明确。本研究拟进一步研究Rapa调控MDSC来源的外泌体（Exosomes,Exo）对角膜移植免疫排斥反应的影响。方法:（1）MDSC来源Exo的分离与鉴定:免疫磁珠分选法提取
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目的:研究表明雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）通过增强骨髓源性免疫抑制细胞（Myeloid derived suppressed cells,MDSC）的免疫抑制功能,从而抑制角膜移植免疫排斥反应,但具体机制尚不完全明确。本研究拟进一步研究Rapa调控MDSC来源的外泌体（Exosomes,Exo）对角膜移植免疫排斥反应的影响。方法:（1）MDSC来源Exo的分离与鉴定:免疫磁珠分选法提取正常BALB/c小鼠骨髓中的MDSC,分为Rapa（100nmol/L）处理组（Rapa-Exo组）和普通未处理组（普通-Exo组）,利用超高速离心法提取MDSC培养上清液中的Exo,并通过透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）与蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）鉴定Exo。（2）穿透性角膜移植模型构建与Exo干预治疗:构建小鼠异系穿透性角膜移植模型,并随机分为Rapa-Exo组、普通-Exo组和观察组。移植术后第二天开始行结膜下注射,Exo的浓度为100ug/ml,剂量为10ul/次,3天/次,共注射3次。每两天进行裂隙灯拍照观察植片排斥状况,记录植片排斥发生的时间并绘制植片生存曲线。（3）MDSC-Exo抗角膜移植排斥的效果评价:移植术后14天,取以上3组角膜,行HE染色观察比较各组植片的炎症严重程度。提取各组植片的RNA经Real time PCR法检测角膜中IL-1β、IL-12、IL-17A、CCR7、IFN-γ的表达水平。提取各组植片蛋白,应用商品化ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-17A、IFN-γ因子水平。（4）MDSC-Exo抗角膜移植排斥的机制探讨:将Rapa-Exo及普通-Exo分别进行转录组学测序,筛选差异表达的miRNA,并进行靶基因预测和KEGG富集分析。结果:（1）MDSC-Exo的鉴定:通过TEM观察经超高速离心法获得的Exo,其形态呈现典型Exo电镜表现,为双凹圆形或一侧凹陷的半球状的双层囊泡结构。根据镜下标尺测量,粒子直径约在50nm-150nm之间。WB结果显示所获微粒CD81、CD9、CD63分子表达均为阳性。以上结果初步表明成功分离MDSC-Exo。（2）Exo治疗小鼠角膜移植排斥的临床观察:各组植片存活的平均时间分别为Rapa-Exo组（23.7±1.8）d、普通-Exo组（16.2±1.8）d、观察组（14.9±1.9）d,Rapa-Exo组的植片平均存活时间明显长于后两组,且具有统计学意义（P<0.05）。Kaplan-Meier法分析各组植片生存情况,Rapa-Exo组的植片生存情况优于普通MDSC-Exo组及观察组,差异具有统计学意义（P<0.001）。（3）Exo抗免疫排斥的效果评价:HE染色结果显示:观察组炎症反应最强,普通-Exo组较强,而Rapa-Exo组仅轻度炎症。通过Real time PCR检测各组植片中IL-1β、IL-12、IL-17A、CCR7、IFN-γ表达水平,结果显示各炎症相关因子的表达由强到弱依次为:观察组,普通-Exo组,Rapa-Exo组（P<0.05）。Elisa法检测各组植片中细胞因子IL-17a、IFN-γ、IL-1β的表达水平,结果显示各细胞因子的含量由高到低依次为:观察组,普通-Exo组,Rapa-Exo组（P<0.05）。（4）Exo抗角膜移植免疫排斥的机理探讨:其中显著上调的miRNA对应的靶基因主要富集在Notch信号通路、Hippo信号通路及精氨酸生物合成代谢通路等KEGG通路。显著下调的miRNA对应的靶基因富集的KEGG通路主要包括皮质醇合成和分泌信号通路及磷脂酶D信号通路等。结论:（1）Rapa预处理MDSC来源的Exo,经结膜下注射后可以有效延缓小鼠角膜移植免疫排斥反应,延长植片的存活时间。（2）Rapa调控MDSC的可能机制是通过调控Notch信号通路、Hippo信号通路及精氨酸生物合成代谢通路等途径,从而增强其抗免疫排斥的效果。
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