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金丝桃素是贯叶连翘中具有抗肿瘤和抗病毒活性的一种含量较低的萘骈二蒽酮类化合物,目前所采用的提取方法存在很多不足,致使该化合物的提取率较低。本研究采用经电子束和重离子束辐照诱变的黑曲霉和绿色木霉所分泌的纤维素酶作为植物细胞壁裂解剂,通过优化酶解条件提高该化合物的提取率,减少贯叶连翘资源的浪费。同时应用微波辅助合成的方法对金丝桃素的化学合成路线进行了优化,提高了反应的收率,降低了副产物的生成量。主要研究内容如下:（1）对黑曲霉GSICC 60108和绿色木霉GSICC 62010的产酶条件进行了优化,所得黑曲霉的最佳发酵工艺为:培养时间72 h,接种量8.0%,培养温度28℃,初始pH值4.5,表面活性剂Tween-80的添加量为1.0%,最佳的碳源为稻草粉,最佳的氮源是以1:5的比例进行配比的硫酸铵和麸皮的混合物。绿色木霉的最佳培养温度35℃,初始pH值5.0,其余条件同黑曲霉。（2）建立了产纤维素酶菌株的高通量筛选方法,采用刚果红-纤维素平板初筛和新建立的高通量微孔板法复筛进行突变体的筛选。所建复筛方法的回归方程为Y=0.208X+0.0006,标准曲线在0 mg/mL-10 mg/mL的浓度范围内线性较好,线性相关系数为0.99975。其精密度、重现性和稳定性均能够满足高通量筛选的要求。与国际通用的滤纸酶活力测定方法相比,测定结果无显著差异。（3）以黑曲霉GSICC 60108和绿色木霉GSICC 62010为初始菌株,对其单孢子悬液进行电子束辐照。黑曲霉和绿色木霉孢子的致死剂量分别为1000 Gy和750 Gy,且分别在750 Gy和500 Gy的辐照剂量下所得滤纸酶活力最高,正突变率也为各剂量中最高,分别达到了12.0%和11.0%。对这两个剂量进行筛选后得到黑曲霉EBA 105和绿色木霉EBT 18两个突变株,其R值分别为3.9和3.5。黑曲霉EBA 105的滤纸酶活力为152.5 FPU/mL,纤维素内切酶活力为91.4 IU/mL,纤维素外切酶活力为29.6 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活力为35.3 IU/mL,较初始菌株提高了2.6倍-3.2倍。绿色木霉EBT 18的滤纸酶活力、纤维素内切酶活力、纤维素外切酶活力和β-葡萄糖苷酶活力分别为186.9 FPU/mL、108.2 IU/mL、61.3 IU/mL和153.3 IU/mL,较初始菌株提高了3.3倍-3.9倍。对突变体纤维素酶基因的序列分析表明,辐照后的突变以点突变占多数。（4）为获得更高纤维素酶活力的突变体,采用12C6+离子束对黑曲霉EBA 105和绿色木霉EBT 18进行了再次诱变,黑曲霉孢子的辐照致死剂量为150 Gy,绿色木霉孢子为125 Gy。黑曲霉和绿色木霉分别在80 Gy和70 Gy的辐照剂量下所得滤纸酶活力最高,正突变率也是各剂量中的最高值,分别为11.0%和16.0%。对这两个剂量进行筛选后得到黑曲霉CIA 915和绿色木霉CIT 626两个突变株,其R值分别为5.3和5.5。黑曲霉CIA 915的滤纸酶活力为431.6 FPU/mL,纤维素内切酶活力为310.8 IU/mL,纤维素外切酶活力为106.2 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活力为95.9 IU/mL,较出发菌株黑曲霉EBA 105提高了2.7倍-3.6倍。绿色木霉CIT 626的滤纸酶活力、纤维素内切酶活力、纤维素外切酶活力和β-葡萄糖苷酶活力分别为535.3 FPU/mL、336.5 IU/mL、231.8 IU/mL和437.6 IU/mL,较出发菌株提高了2.9倍-3.8倍。对突变体纤维素酶基因的序列分析表明,主要的突变类型为点突变。（5）采用20Ne10+离子束对黑曲霉EBA 105和绿色木霉EBT 18进行了再次诱变,该重离子束对黑曲霉和绿色木霉孢子的致死剂量分别为125 Gy和100 Gy。黑曲霉和绿色木霉分别在90 Gy和80 Gy的辐照剂量下所得滤纸酶的活力最高,其正突变率也为各剂量中较高,均为9.0%。对这两个剂量进行筛选后得到黑曲霉NIA 301和绿色木霉NIT 385两个突变体,其R值分别为3.6和4.2。黑曲霉NIA 301的滤纸酶活力为293.8 FPU/mL,纤维素内切酶活力为176.5 IU/mL,纤维素外切酶活力为61.3 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活力为68.1 IU/mL,较出发菌株黑曲霉EBA 105提高了1.9倍-2.1倍。绿色木霉NIT 385的滤纸酶活力、纤维素内切酶活力、纤维素外切酶活力和β-葡萄糖苷酶分别为325.2 FPU/mL、183.5 IU/mL、110.2 IU/mL和275.8 IU/mL,较出发菌株提高了1.7倍-1.8倍。对突变体纤维素酶基因的序列分析表明,辐照后的突变类型以点突变为主。（6）获得纤维素酶高产菌株后,对黑曲霉CIA 915和绿色木霉CIT 626的粗酶液进行了精制和配比,结果表明黑曲霉和绿色木霉的酶液以1:6的比例配比时能获得最大的滤纸酶活力。最佳的酶辅助提取工艺条件为:初始pH值5.0,温度40℃,时间6 h,酶浓度150.0 FPU/g,固液比1:2。经酶辅助提取后所得金丝桃素的提取率为166.5μg/g,较超声提取法提高了46.7%。对酶解前后贯叶连翘粉末的微观结构观察的结果表明,样品经纤维素酶降解后微观形貌发生了较大变化,这也为纤维素的大量降解提供了佐证。（7）应用微波辅助合成的方法,对金丝桃素合成路线中的大黄素蒽酮缩合反应分别在微波加热温度、辐射时间和催化剂三个方面进行优化,确定了最佳的反应条件:温度为150℃,反应时间1 h,不使用催化剂。该步反应所得收率可达到82.2%,整个合成路线的总收率为74.3%。综上所述,由电子束和12C6+离子束复合诱变所得突变体的纤维素酶活力最高,所得高产酶源菌及其酶液不仅对贯叶连翘中金丝桃素的提取有较好促进作用,而且也可应用于其它行业。此外,本文中金丝桃素的微波辅助合成较常规加热提高了反应的效率和收率,减少了副反应的发生,使合成工艺更加低碳环保。