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【研究背景及目的】结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤,转移、复发是该病的主要死因,其转移机制已成为目前的研究热点。近年来,越来越多研究表明上皮细胞间质转化(EMT)对结直肠癌细胞侵袭、转移能力的增强发挥关键作用。Martin等学者研究表明,三联组氨酸结合蛋白2(Histidine triad nucleotide-binding 2,HINT2)对肿瘤组织的生长起抑制作用,且该蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡。我们前期研究发现,结肠癌组织中HINT2表达量明显低于正常结肠组织,且HINT2对SW480结肠癌细胞的迁移、侵袭能力具有抑制作用。因此,本课题的目的是探究HINT2在结直肠癌细胞EMT中的作用,并探讨相关的分子机制。【实验方法】1.建立稳定沉默HINT2的SW480细胞系将结肠癌细胞系SW480感染重组慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles(sc-92707-V)的方法敲除HINT2,并用有限稀释克隆法建立稳定沉默细胞系。2.检测HINT2对SW480结肠癌细胞株EMT的影响2.1.利用慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles感染结直肠癌细胞株SW480,下调细胞株中HINT2表达,显微镜下观察细胞形态变化,利用Western blot方法检测HINT2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达量变化情况。2.2.构建包含E-cadherin启动子结合位点的报告基因质粒,转染入Hint2 shRNA(h)Lentiviral Particles、Control sh RNA Lentiviral Particles-A的SW480细胞株,通过检测荧光素酶表达水平预测HINT2对E-cadherin基因转录的调节作用。3.观察HINT2变化对SW480结直肠癌细胞株迁移及侵袭能力的影响用细胞划痕试验及Transwell试验检测不同HINT2表达水平对SW480细胞迁移、侵袭能力的影响。4.探讨HINT2抑制SW480细胞EMT的分子机制4.1.利用Real-time PCR检测下调HINT2表达对SW480细胞EMT相关转录因子SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2、TWIST1、TWIST2表达的影响。4.2.制备HINT2与ZEB1双干扰慢病毒HINT2+ZEB1 shRNA Lentiviral Particles。4.3.利用慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 sh RNA Lentiviral Particles或Control sh RNA Lentiviral Particles-A感染结肠癌细胞株SW480,利用Western blot方法检测HINT2、ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达量变化情况。4.4.构建包含E-cadherin启动子结合位点的报告基因质粒,转染入Hint2 shRNA(h)Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 sh RNA Lentiviral Particles或Control sh RNA Lentiviral Particles-A的SW480细胞株,通过检测荧光素酶表达水平预测ZEB1在HINT2介导的E-cadherin基因转录调节中的作用。5.统计学分析釆用SPSS 22.0进行统计分析,所有的结果都以均数±标准差表示,采用t检验,P<0.05有统计学意义。【实验结果】1.成功建立低表达HINT2的SW480细胞系。2.在SW480细胞中小干扰HINT2后,细胞形态由浑圆变得细长,出现梭形触角,E-cadherin表达下降,N-cadherin、Vimentin表达量明显上升。3.荧光素酶报告基因试验结果显示HINT2通过转录水平促进E-cadherin表达。4.利用慢病毒载体下调HINT2表达后,细胞划痕试验及Transwell方法检测结果显示HINT2显著抑制SW480细胞的侵袭、迁移能力。5.在SW480细胞中同时干扰HINT2及ZEB1后,EMT分子标记物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)表达量相较对照组无明显变化。荧光素酶报告基因试验结果显示在SW480细胞中同时干扰HINT2及ZEB1,E-cadherin启动子活性相较对照组未发生变化。【结论】1.HINT2可抑制SW480结直肠癌细胞的EMT。2.HINT2可正性调控SW480结直肠癌细胞E-cadherin的转录。3.HINT2可有效抑制结直肠癌细胞的迁移侵袭能力。4.ZEB1是低表达HINT2诱导结直肠癌细胞EMT所必需的。5.低表达HINT2对E-cadherin转录活性的负性调控依赖于ZEB1表达