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糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)发病率高,视力损伤程度重。目前临床上主要采用视网膜激光、抗VEGF药物、糖皮质激素等进行治疗,但单一疗法均有相应的不足。抗VEGF药物作目前为临床一线用药,能够有效减轻黄斑水肿程度,但疗效短、需反复注射、价格昂贵。中药在DME治疗中具有独特优势。本课题组采用补阳汤加减方联合康柏西普治疗DME,通过临床及实验两部分研究,验证补阳汤加减方临床疗效并探索其作用机制,以期优化DME临床治疗方案。目的:1.以康柏西普(Conbercept)注射液连续多次注射治疗为对照,初步评价中药补阳汤加减方联合康柏西普注射液单次注射治疗糖尿病黄斑水肿的有效性、安全性。2.建立高糖下的人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cell,HRMEC)模型,为探索中药补阳汤加减方的机制奠定基础。3.观察中药补阳汤加减方对高糖下人视网膜微血管内皮细胞增殖能力、血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor,VEGF)及紧密连接(tight junction,TJ)蛋白occludin的干预作用,探讨其保护人血-视网膜内屏障(inner blood-retinal barrier,i-BRB)的作用机制。为中药补阳汤加减方治疗糖尿病黄斑水肿提供实验性依据。方法:1.临床研究方法:应用前瞻性、非劣效设计原则,采用多中心、随机、对照方法,将符合纳入排除标准的 135例糖尿病黄斑水肿患者按分配比例2:1随机分为2组。治疗组予中药口服4个月,联合玻璃体腔注射康柏西普 1次;对照组予玻璃体腔注射康柏西普连续3次。2组均在第4个月后进行主要疗效指标评价,随访3个月,记录治疗前以及每月随访的最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA)、中心视网膜厚度(central retinal thickness,CRT)、中医证候评分、化验检查、眼部体征及联合用药等情况,以BCVA、CRT为主要疗效评价指标,以肝肾功能化验值作为安全性指标,评价中药补阳汤加减方联合康柏西普注射液单次注射治疗DME的有效性、安全性。2.实验研究方法:(1)采用葡萄糖浓度为25mmol/L的DMEM完全培养基处理HRMEC,分别于培养24h、48h后通过CCK8方法检测细胞生存活力,建立高糖下人视网膜微血管内皮细胞模型。(2)制备SD大鼠含药血清及空白对照血清,采用CCK8方法检测补阳汤加减方含药血清对高糖下人视网膜微血管内皮细胞增殖的影响。(3)建立高糖下人视网膜微血管内皮细胞模型,以低、中、高剂量含药血清及空白对照血清分别干预高糖及正常糖浓度下的人视网膜微血管内皮细胞。采用RT-PCR方法检测各组HRMEC细胞中VEGF、occludin的mRNA表达水平;采用western-blot方法检测各组HRMEC细胞中VEGF、occludin蛋白的相对表达情况。结果:1.临床研究(1)主要疗效指标较基线变化情况:试验组BCVA随访一个月较基线变化5.46±7.01个字母,二个月较基线变化4.7±9.62个字母,三个月较基线变化2.22±8.48个字母,四个月较基线变化2.51±9.83个字母,七个月远期随访较基线变化4.05士6.22个字母。对照组BCVA随访一个月较基线变化3.66±9.42个字母,二个月较基线变化4.56±8.77个字母,三个月较基线变化6.23±6.58个字母,四个月较基线变化3.08±7.57个字母,七个月远期随访较基线变化1.44±7.07个字母。试验组CRT随访一个月较基线变化-132.71±121.82μm,二个月较基线变化-75.69±134.25μm,三个月较基线变化-33.04±129.01μm,四个月较基线变化-61.7±129.79μm,七个月远期随访较基线变化-39.94±144.88μm。对照组CRT随访一个月较基线变化-135.67士 137.56μm二个月较基线变化-175.84±139.76μm,三个月较基线变化-185.19±130.29μm,四个月较基线变化-129.85±155.18μm,七个月远期随访较基线变化-69.89±127.83μm。(2)主要疗效指标治疗结果判定情况:试验组黄斑水肿程度较基线减轻≥50%的共有3例(3.75%),减轻≥25%且<50%的共有50例(62.5%),无变化或水肿程度加重的共有27例(33.75%);对照组黄斑水肿程度较基线减轻≥50%的共有4例(9.7%),减轻≥25%且<50%的共有27例(65.85%),无变化或水肿程度加重的共有10例(24.39%)。试验组最佳矫正视力较基线提高≥10个字母的共有13例(16.25%),提高≥5且<10个字母的共有36例(45%),无变化或视力下降的共有31例(38.75%);对照组最佳矫正视力较基线提高≥10个字母的共有8例(19.51%),提高≥5且<10个字母的共有15例(36.58%),无变化或视力下降的共有18例(43.9%)。试验组总体有效率结果:显效15例(18.75%),有效47例(58.75%),无效18例(22.5%);对照组总体有效率结果:显效11例(26.83%),有效 24 例(58.54%),无效 6 例(14.63%)。(3)主要疗效指标非劣效检验结果:试验组与对照组总有效率差值-7.86%,Cu=8.11%,低于非劣界值20%,拒绝无效假设,总有效率中药联合治疗组非劣效于康柏西普对照组,非劣效检验成立;试验组与对照组BCVA有效率差值6.07%,Cu=13.41%,低于非劣界值20%,拒绝无效假设,BCVA有效率中药联合治疗组非劣效于康柏西普对照组,非劣效检验成立;试验组与对照组CRT有效率差值-9.35%,Cu=7.39%,低于非劣界值20%,拒绝无效假设,CRT有效率中药联合治疗组非劣效于康柏西普对照组,非劣效检验成立。2.实验研究(1)补阳汤加减方含药血清对细胞增殖的影响:高糖25mmol/L HRMECs增殖系数大于低浓度5mmol/L。实验组HRMECs增殖系数显著低于模型对照组(P=0.025),仅低剂量实验组组24h与正常对照组差异较小,增殖系数接近(P=0.19)。(2)补阳汤加减方含药血清对HRMEC细胞VEGF表达的影响:模型对照组VEGF的mRNA表达显著高于正常对照组(P=0.000);所有实验组的VEGF目的基因相对表达量均低于模型对照组,组间比较有统计学差异(P<0.05);中剂量实验组对VEGF的mRNA表达影响最大。正常对照组VEGF蛋白表达低于模型对照组(P=0.037);中剂量、高剂量含药血清组VEGF蛋白表达量下降,尤其是中剂量含药血清组,组间比较有统计学差异(P<0.05)。(3)补阳汤加减方含药血清对HRMEC细胞occludin表达的影响.:正常对照组occludin蛋白mRNA表达高于模型对照组,组间比较有统计学差异(P=0.033)。所有实验组均可增加occludin蛋白mRNA表达,低剂量实验组、中剂量实验组与模型组相比较,表达量增加显著(P<0.05),高剂量含药血清组与模型组相比较差异较小,两组间比较无统计学差异(P=0.156)。正常对照组occludin蛋白相对表达量明显高于模型组,组间比较有统计学差异(P=0.000);所有实验组occludin蛋白表达较模型组均升高,低剂量实验组相对表达量最高,组间两两比较有显著性差异(P<0.05)。结论:1.中药补阳汤加减方联合康柏西普单次注射方案治疗DME的疗效非劣效于康柏西普三次连续注射方案,可以提高最佳矫正视力,减轻黄斑水肿,改善患者全身症状。联合方案有效、经济、安全。2.高糖(25mmol/L)干预HRMEC后可引起细胞增殖、VEGF表达增加、紧密连接蛋白occludin表达减少,使细胞功能紊乱,25mmol/L糖浓度可建立稳定的高糖人视网膜微血管内皮细胞实验模型。3.中药补阳汤加减方含药血清可通过抑制高糖环境引起的异常增殖而干预DME发病;通过减少VEGF因子的表达、增加occludin蛋白的表达,以保护血-视网膜内屏障功能,而起到治疗DME的作用。