人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）来源于植入前人类囊胚的内细胞团（inner cell mass, ICM）,是一种具有多向分化潜能和无限自我复制能力的特定细胞类型,为临床细胞替代治疗和人类胚胎发育机制研究等提供了理想的材料。目前,制约hESCs研究的一个重要的因素就是hESCs培养体系,目前普遍采用的是饲养细胞培养体系,饲养细胞培养体系由于其需要强度很到的劳动量和不稳定性,生产的hESCs细胞产量远不能够满足临床和实验研究的需要,建立简单稳定的无饲养细胞培养体系成为迫切的要求,同时无饲养细胞培养体系有助于阐明hESCs维持未分化状态的机制,也是hESCs定向诱导分化的基础,也可以消除hESCs |临床应用必需考虑动物源性成分带来潜在的危险性。本研究的主要内容是建立一种无饲养细胞hESCs体外培养体系,并对该无饲养细胞培养体系进行了初步研究。本论文第一章的研究内容是建立了一种新的hESCs无饲养细胞培养体系（称之为NB体系）,对该培养体系下培养的hESCs鉴定结果显示, NB体系下hESCs和有饲养细胞培养体系下hESCs一样维持了自身的未分化状态,表现出典型的未分化hESCs外观,细胞高核质比,免疫细胞化学检测结果显示为Oct4、SSEA-4、TRA-A-60为阳性,AKP染色呈阳性,表达多能性基因Oct4、Sox2、Nanog和Rexl,在畸胎瘤中观测到三胚层的细胞形成的组织结构,具有向三胚层分化的潜能。hESCs解冻后依然保持了未分化状态。hESCs在NB培养体系培养的过程中,几乎所有的种植克隆处于未分化状态。同时,我们比较了4ng/ml、40ng/ml和100ng/mlFGF2对hESCs维持状态的维持作用,结果表明,在4ng/ml FGF2浓度下（NB4体系）,未分化克隆百分比在无饲养细胞培养早期出现V字形波动,而40ng/ml（NB40体系）和100ng/ml FGF2 （NB100体系）始终维持高水平的未分化克隆百分壁,随着无饲养细胞传代的持续进行,当传代培养8-11代时,三种浓度FGF2条件下的hESCs未分化克隆百分比接近一致,说明高FGF2浓度对hESCs从有饲养细胞体系转入到无饲养细胞体系时存在支持作用。总的来说,NB体系是一个非常稳定高效的无饲养细胞培养体系,不受饲养细胞波动的影响。论文第二章主要研究内容是常规人源性饲养细胞培养体系下（human embryonic feeder independent culture system, HEF体系）和NB体系下hESCs特性比较。在本章节中,我们采用了细胞倍增时间,细胞周期,细胞凋亡,SSEA4和TRA-1-60 FACS分析,EBs分化倾向以及畸胎瘤评级等指标来显示2种培养体系下hESCs存在的差异。结果显示,与有HEF体系相比较,NB体系下的hESCs具有较短的细胞倍增时间,HEF、NB4、NB40和NB100条件下平均细胞倍增时间分别为40.07±2.01 hrs、37.33±0.79 hrs.30.94±1.63 hrs和29.22±2.29 hrs,而细胞周期在这四种条件没有明显的改变,S期所占的百分比分别为41.75%±1.05%,42.90%±3.02%,41.48%±2.04%和41.34%±5.72%,细胞凋亡分别为10.8%±1.51%,8.44%±1.11%、5.96%±1.27%和3.61±%1.05%,说明,NB体系下hESCs增殖速度快主要的因素是抑制了细胞的凋亡,且与FGF2浓度存在正相关,与细胞周期没有直接的联系。就TRA-1-60和SSEA4的FACS分析结果来说,HEF、NB4. NB40和NB100体系下TRA-1-60阳性hESCs比率分别为71.6%±1.80%、93.0%±2.8%、87.8%±1.8%、83.1%±7.8%,而SSEA4阳性hESCs比率分别为81.5±5.46%,97.3%±0.8%、95.5%±2.5%、95.9%±2.4%,NB体系下的hESCs具有相对比较高的纯度,尤其是NB4培养体系；当NB体系下培养后的hESCs转回到HEF体系培养后,TRA-1-60和SSEA4阳性hESCs比率下降,介于HEF体系和NB体系之间,NB4、NB40和NB100转回HEF体系后TRA-1-60+细胞比率分别为86.1%6±4.6%、84.8%±2.0%、87.6%±1.0%,SSEA4+胞比率分别为89.2%±1.9%、85.8%±1.2%、87.9%±0.7%。在EBs自发分化倾向上,NB体系下的hESCs表现出分化抑制现象,主要体现在EBs分化过程中对多能行基因（Oct4、Nanog和Rex1）的持续高表达和对三胚层（外胚层分化基因Sox3、Pax6、Soxl,中胚层分化基因Brachyury,内胚层分化基因Sox17、AFP、GATA6）分化基因的低表达以及不表达。将NB体系下的hESCs重新转入到有饲养细胞培养体系培养后,在培养第11代时,培养中的hESCs出现了分化克隆,于第13代时进行EBs分化倾向检测,发现NB体系下来源的有饲养细胞体系下的hESCs的分化倾向得到一定程度的恢复,在EBs的培养过程中虽然高表达多能性基因,但是三胚层分化基因的表达得到了恢复,包括了外胚层分化基因Sox3、Pax6、Soxl,中胚层分化基因Brachyury,内胚层分化基因Sox17、AFP、GATA6。其中以NB4体系下hESCs恢复的比较完全,NB体系下高剂量的FGF2对hESCs分化能力的恢复存在抑制作用。HEF体系和NB体系下hESCs发生的分化倾向的改变可能与自身表面标记分子阳性率的改变相关。总的来说NB体系下的hESCs比有饲养细胞培养体系下的hESCs具有高的细胞增殖能力,低细胞凋亡,具有较高的细胞纯度,在EBs分化能力上受到一定的限制,但是在重新转入到饲养细胞培养体系后,其分化潜能可以得到不同程度的恢复,尤其是NB4体系下的hESCs,其TRA-1-60和SSEA4阳性细胞比率逐渐恢复到HEF体系下水平,hESCs分析倾向的改变可能与其自身表面分子标记物阳性比率相关。论文第三章节主要内容是研究hESCs自分泌对维持自身未分化状态的作用。经过检测发现,培养中的hESCs自身表达了多种维持自身未分化状态的细胞因子,如FGF2、FGF4和Nodal等,同时也表达促进细胞分化的细胞因子,如BMP家族成员BMP2.BMP4和BMP7等。hESCs自身可以改变自身的微环境,与含有SR的培养体系相比较,NB体系具有的BMP样诱导活性较低,但是当hESCs克隆种植较高（100克隆/cm2）时,NB培养体系的BMP样诱导活性得到增强；在含有SR的培养体系中也得到了类似的结果。由于hESCs自身表达了FGF2,存在FGF信号通路的自分泌,为了检测这种自分泌强度,当hESCs在NB体系下的培养过程中撤除外源性的FGF2后,hESCs自身并没有发生分化现象,同时,当hESCs从HEF体系转入到NB体系时,在没有加入外源性的FGF2的条件下,hESCs同样可以维持自身的未分化状态,表达多能性基因Oct4、Nanog和Rex1和多能性标记Oct4、TRA-1-60和SSEA4。当然,hESCs分泌了其他的未知的细胞因子,对这些细胞因子的分离和鉴定后,在培养体系中加入对hESCs维持未分化状态的细胞因子和抑制促进分化的细胞因子的功能,可以优化和完善NB体系。国内外的研究表明,hESCs分泌的细胞因子有助于hESCs的建系,所以对hESCs自分泌的研究为hESCs无饲养细胞建系和培养提供新的思路和方向。总的来说,无饲养细胞体系一NB体系是一个稳定的高效的无饲养细胞hESCs培养体系,在该体系中,hESCs细胞的自分泌可以维持hESCs自身未分化状态,hESCs自分泌为研究hESCs建系和阐明维持未分化状态的机制提供新的思路和方法。