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目的:妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）指的是在孕期任何孕周发现的不同程度的糖耐量异常,我国目前应用的诊断标准是国际糖尿病和妊娠研究组（International Association of Diabetes and Pregnancy Study Group IADPSG）以及美国糖尿病学会（Americn Diabetos Association,ADA）指南里的75g葡萄糖耐量实验（OGTT）。妊娠期糖尿病的发病率逐年升高,对母儿均造成不良影响,并且易合并妊娠期高血压疾病、胎儿畸形、羊水过多、早产等,从而导致母儿不良结局。其发病机制目前仍未完全阐明,普遍认为与2型糖尿病的发病机制相类似,与胰岛素抵抗及糖代谢异常相关。而孕期因有胎盘因素影响,使妊娠期糖尿病的病理生理改变更加复杂。性激素结合球蛋白（Sex hormone-binding globulin,SHBG）是一种能与性激素甾体结合的球蛋白,目前认为其主要由肝脏合成并分泌,近期研究多集中于如肥胖、多囊卵巢综合征、糖尿病等的代谢综合症方面。有研究表明SHBG可由胎盘分泌并参与妊娠期糖尿病的发生,早孕期的SHBG水平降低可用于早期预测妊娠期糖尿病的发生,也是孕妇发生胰岛素抵抗的独立危险因素,但目前其信号转导通路及作用机制尚不明确。在胰岛素通路中,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路较为经典,调节脂肪细胞的分化和增殖等。而RAS-RAF-MEKERK为MAPK家族的经典通路,参与大量的细胞生物学行为的调节,包括细胞粘附、周期、迁移、生存、分化、代谢和转录等,可促进细胞分裂及增殖,从而促进组织生长,并可通过调节胰岛素信号通路而放大其作用,在胰岛素抵抗中发挥作用,从而影响糖尿病的发生及发展。有研究表明增强的ERK和糖脂代谢增加、脂肪细胞因子表达失调有关。糖尿病生成因子通过激活ERK通路来影响胰岛素抵抗,标记ERK通路是胰岛素抵抗和2型糖尿病的潜在治疗方法。本实验通过研究胎盘滋养细胞内SHBG与RAS/RAF/ERK通路间的关系,在胎盘组织中应用Real-time PCR、Western Blot等方法检测SHBG与通路各指标的表达,并探寻之间的相关性。在滋养细胞系中转染高表达SHBG质粒及沉默SHBG,检测各通路指标的改变,并观察其对滋养细胞生物学行为的影响,从而进一步了解SHBG的作用机制。在SHBG全基因敲除鼠模型中应用免疫组化法检测SHBG与各通路指标,在整体动物水平评价SHBG与RAS/RAF/ERK通路的关系,进一步验证其相关性,为治疗妊娠期糖尿病提供新靶点和可能。研究方法:1.根据ADA推荐的诊断标准选取2017年于盛京医院分娩的妊娠期糖尿病孕妇30人,采集的胎盘均来自足月剖宫产手术,选取同期无产科合并症的OGTT正常孕妇作为对照组。应用Real-time PCR和Western blot等方法检测妊娠期糖尿病孕妇组和糖耐量正常孕妇组的胎盘组织中SHBG、RAS/RAF/ERK通路各转导因子的表达,并检测其相关性。2.构建SHBG沉默及高表达的质粒,对HTR-8/SV neo滋养细胞系进行相应转染,沉默及过表达SHBG,通过Real-time PCR及Western blot等方法检测RAS/RAF/ERK通路因子的表达改变,在差异性表达SHBG的滋养细胞系中检测细胞增殖、周期及凋亡的变化。3.应用免疫组化法测定SHBG基因敲除小鼠妊娠模型与野生型小鼠的胎盘组织中SHBG、RAS、RAF1、P-ERK的表达情况,在整体动物水平评价SHBG与RAS/RAF/ERK信号传导通路的关系。结果:1.SHBG及RAS/RAF/ERK各通路相关指标在妊娠期糖尿病孕妇组胎盘组织中的改变:在妊娠期糖尿病孕妇组和糖耐量正常孕妇对照组的胎盘组织中,分别应用Real-time PCR和Western blot检测SHBG、RAS、RAF、ERK1/2、P-ERK的表达,发现不论是m RNA水平还是蛋白水平,妊娠期糖尿病孕妇组的SHBG水平均低于糖耐量正常孕妇对照组,而RAS、RAF、ERK1/2、P-ERK、P-ERK/ERK的表达量明显高于糖耐量正常孕妇对照组,并且均与SHBG的表达呈负相关性。2.在HTR8/SV-neo滋养细胞中,改变SHBG表达量后ERK通路相关指标的变化:通过质粒转染的方法差异性表达SHBG,m RNA水平及蛋白水平上均发现在SHBG高表达组中,RAS、RAF、ERK1/2、P-ERK、P-ERK/ERK的表达均降低,而在SHBG低表达组中,各通路指标表达均升高。3.改变SHBG表达量后滋养细胞生物学行为的变化:SHBG高表达组滋养细胞的增殖能力降低,沉默组反之,24小时及48小时有差异;SHBG高表达组滋养细胞的凋亡增加,沉默组降低,与对照组间差异统计学意义;SHBG高表达组的细胞周期中S期降低,与对照组间有差异。4.在SHBG基因敲除小鼠中SHBG与RAS/RAF/ERK通路相关指标的变化:在SHBG基因敲除小鼠的胎盘组织中SHBG为阴性表达。SHBG基因敲除小鼠胎盘组织中的RAS/RAF/ERK各通路指标的表达均高于野生型小鼠胎盘组织,有统计学差异。结论:1.妊娠期糖尿病孕妇胎盘内SHBG表达降低,而RAS、RAF、ERK表达升高,并且均与SHBG呈负相关,考虑在胎盘中SHBG可能与RAS/RAF/ERK通路存在一定的负相关性。2.在滋养细胞中转染过表达SHBG,RAS/RAF/ERK通路的表达降低,而应用si RNA沉默SHBG时各通路指标表达升高,考虑在滋养细胞中SHBG可能通过抑制RAS/RAF/ERK通路发挥作用。3.转染过表达SHBG可降低滋养细胞的增殖能力,而凋亡增加,沉默组与之相反,同时SHBG高表达组的S期降低,考虑SHBG可使滋养细胞增殖减少而凋亡增加,并且通过RAS/RAF/ERK通路调节滋养细胞的生物学行为。4.在基因敲除整体动物水平发现SHBG与RAS/RAF/ERK通路各指标呈负相关性,与胎盘组织及细胞系中的研究结果一致。