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研究背景和目的支气管哮喘是呼吸道较为常见的慢性炎症性疾病,其发病机制由多种细胞参与。近年来,我国哮喘发病率不断增加,虽然糖皮质激素和β-2受体激动剂是目前哮喘症状控制的常用药物,但是激素抵抗和长期使用激素引起的副作用仍不能解决。微小RNA(miRNA)参与哮喘气道炎症、气道高反应、黏液分泌和气道重构等病理生理过程,在哮喘的发病和发展中起着重要作用。本研究拟在体外通过LPS构建支气管上皮细胞系(BEAS-2B)炎症模型,探索miR-29b-3p对支气管上皮细胞炎症反应的影响及可能机制。期望通过本实验,进一步揭示哮喘的发病机制及为哮喘治疗提供新的方向。研究方法1、LPS对支气管上皮细胞系(BEAS-2B)细胞活力影响。首先用不同浓度(0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)的LPS处理BEAS-2B细胞12h后,CCK-8法检测细胞活力。2、LPS对BEAS-2B细胞炎症因子的产生和miR-29b-3p的表达影响。1μg/mL LPS处理BEAS-2B细胞12h后,实时荧光定量PCR法检测炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和miR-29b-3p的表达变化。3、miR-29b-3p对LPS刺激的BEAS-2B细胞炎症反应的影响饥饿培养BEAS-2B细胞6h后,分别向细胞内转染miR-29b-3p mimic或inhibitor及相应阴性对照物,12h后实时荧光定量PCR检测miR-29b-3p的表达水平。LPS处理转染后的BEAS-2B细胞12h,实时荧光定量PCR检测IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平变化。4、miR-29b-3p对AKT2和LPS诱导的p-AKT2的影响饥饿培养BEAS-2B细胞6h后,分别向细胞内转染miR-29b-3p mimic或inhibitor及相应阴性对照物12h,荧光定量PCR和Western Blot分别检测AKT2的mRNA和蛋白表达情况。再予LPS处理BEAS-2B细胞12h,Western Blot法测定p-AKT2的蛋白表达。5、miR-29b-3p对AKT2下游转录因子NF-κB信号通路的影响饥饿培养BEAS-2B细胞6h后,分别向细胞内转染miR-29b-3p mimic或inhibitor及相应阴性对照物12h,然后LPS处理BEAS-2B细胞12h,Western Blot法测定胞浆和核内NF-κB p65蛋白表达。研究结果1、LPS影响BEAS-2B细胞活力且能够诱导细胞炎症反应和影响miR-29b-3p的表达。与对照组相比,各不同浓度的LPS均能对BEAS-2B细胞活力产生影响,LPS浓度越高抑制效果越明显。根据上述结果予1μg/mL处理BEAS-2B细胞,与对照组相比,BEAS-2B细胞在LPS刺激后IL-6、IL-8和TNF-α的相对mRNA表达水平显著增加。同时与对照组相比,LPS处理组的miR-29b-3p表达水平下降。2、miR-29b-3p能够抑制LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症反应转染miR-29b-3p mimic后,LPS诱导的炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8的mRNA表达增高水平被明显抑制。相反,转染miR-29b-3p inhibitor后,炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8的mRNA表达水平明显上调。3、miR-29b-3p可影响AKT2和p-AKT2的表达水平调节LPS诱导的炎症反应。在BEAS-2B细胞中转染miR-29b-3p mimic后AKT2的mRNA和蛋白表达降低,转染miR-29b-3p inhibitor后AKT2的mRNA和蛋白表达增高。进一步研究miR-29b-3p对LPS诱导的p-AKT2的影响发现:转染miR-29b-3p mimic后p-AKT2蛋白表达降低,相反,转染miR-29b-3p inhibitor后p-AKT2蛋白表达有所增高。4、miR-29b-3p能影响LPS诱导的BEAS-2B细胞NF-κB p65核移位。LPS刺激BEAS-2B细胞后,细胞质内NF-κB p65减少而细胞核内NF-κB p65增加,说明LPS激活NF-κB通路,促进NF-κB p65核移位,进而导致炎症因子的释放。在LPS刺激的BEAS-2B细胞中,转染miR-29b-3p mimic后NF-κB p65核移位降低,转染miR-29b-3p inhibitor后NF-κB p65核移位增加。研究结论本实验研究通过体外构建LPS诱导支气管上皮细胞炎症模型,发现miR-29b-3p表达降低,进一步研究表明miR-29b-3p可能通过抑制AKT2表达调控AKT2/NF-κB信号通路,进而抑制LPS诱导的支气管上皮细胞BEAS-2B炎症反应。