寡养单胞菌CW117对AFB1和OTA降解特性及分子机制初探

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真菌毒素是由霉菌产生的一类次级代谢产物,其危害性强且分布广泛,具有稳定的化学结构,一经产生便能稳定的存在于环境中,难以自然消解。其中,黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)是真菌毒素中最危险、分布最广泛、最被关注和研究的两种真菌毒素。生物脱毒法是目前已知最为安全和高效的脱毒方法,找到能够降解真菌毒素的生物或者生物酶,研究其脱毒过程中的生物机理并致力于将此应用于生产实践当中,是现阶段生物脱毒法的研究热点。本文研究筛选了一株具有AFB1和OTA双降解功能的寡养食单胞菌(Stenotrophomonas sp.)CW117,该菌株能够在低浓度的毒素污染条件下快速降解AFB1和OTA。将菌株CW117的单菌落接种在AFB1和OTA终浓度为40μg/L的营养肉汤(NB)培养基中,OTA在培养60 h后被完全降解,AFB1在培养96 h后被完全降解。本文探究了菌株CW117对AFB1和OTA的降解成分所在位置,分别用菌株CW117培养液上清,菌体细胞重悬液和菌体细胞破碎液降解AFB1和OTA,结果表明菌株CW117降解AFB1和OTA的活性物质分别存在于培养液上清和菌体细胞中。在以上基础上,对菌株CW117降解两种毒素的最适温度、最适p H值,以及金属离子对毒素降解能力的影响进行了研究。结果表明菌株CW117降解OTA的最适温度在20℃-40℃之间,最适p H在7-8之间;菌株CW117对AFB1的降解能力随着反应温度的升高而升高,最适温度为90℃,中性环境下,降解效果显著,最适p H为6;Cu2+、Ca2+和Zn2+对OTA和AFB1的降解反应均具有有显著地的抑制作用。同时,实验分别用EDTA、EGTA、蛋白酶-K、SDS和100℃加热处理方式,对菌株CW117的两种毒素降解机制作了初步探究。菌体细胞破碎液用EDTA、EGTA和蛋白酶K在35℃条件下预处理6 h后,其OTA降解能力受到显著抑制;用SDS处理菌体破碎液、100℃加热处理后的菌体细胞降解能力消失。降解机制初步研究结果表明,菌株CW117降解OTA的能力来源于胞内蛋白。经过100℃加热和蛋白酶K预处理后的培养液上清对AFB1降解能力与阳性对照没有显著差异;培养液上清经EDTA、EGTA或SDS处理后,对AFB1降解能力与阳性对照存在显著性差异。在此基础上,对菌株CW117基因中编码的漆酶进行克隆、大肠杆菌异源表达、降解活性检测,发现菌株CW117基因组中编码的漆酶对AFB1的具有显著地降解作用。综合以上研究结果推测,菌株CW117对AFB1的降解作用为胞外漆酶和其他无机小分子氧化物共同非特异性氧化降解作用。
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