【摘 要】
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目的:肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率都呈逐年增加的趋势。腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是肺癌最为常见的一种组织学类型,大约占通过手术切除肺癌的50%-70%。浸润性基质细胞和免疫细胞是肿瘤组织中正常细胞的主要组成部分,在肿瘤生物学中具有重要作用。已有研究表明,肿瘤微环境细胞、免疫细胞和基质细胞浸润程度对预后有重要影响。但是,目前很多研究大多针对单个基
【基金项目】
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辽宁省重点研发指导计划项目（2019JH8/10300011）； 沈阳市科技计划项目沈阳市科技计划项目（19-109-4-09）；
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目的:肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率都呈逐年增加的趋势。腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是肺癌最为常见的一种组织学类型,大约占通过手术切除肺癌的50%-70%。浸润性基质细胞和免疫细胞是肿瘤组织中正常细胞的主要组成部分,在肿瘤生物学中具有重要作用。已有研究表明,肿瘤微环境细胞、免疫细胞和基质细胞浸润程度对预后有重要影响。但是,目前很多研究大多针对单个基因对肺腺癌预后的影响,因此本研究旨在建立与肺腺癌微环境有关的多基因生存风险评估模型,以有效地预测肺腺癌患者的预后。研究方法:本研究利用ESTIMATE算法计算肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）数据库中的肺腺癌患者的免疫与基质评分,分析免疫/基质评分与患者亚型、分期、预后的关系。按照其免疫/基质评分中位数分为高、低两组,分析出高免疫评分组与低免疫评分组的差异表达基因,通过COX回归分析进行生存分析,筛选出有生物标志物特性的基因。并通过STRING工具获得蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络,通过g:profiler数据库对有效靶基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析与《京都基因与基因组百科全书》（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析。用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据集验证这些基因后,采用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western Blot）和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）验证。使用肿瘤免疫估算数据库（Tumor Immune Estimation Resource,TIMER）评估了预后基因表达与免疫浸润之间的相关性。基于当前分析中确定的最佳预后特征基因,开发了用于风险分级的特定模型,利用Kaplan-Meier曲线验证了模型预测患者预后的能力,通过整合基于免疫评分的风险分级和临床病理风险因素,进一步构建了总生存预测的列线图。最后从TCGA数据库下载了LUAD的突变数据,分析高低风险组与LUAD患者基因突变频率的关系,并计算了每个样品的肿瘤突变负担（tumor mutation burden,TMB）。结果:1、计算TCGA数据库中495例肺腺癌患者的免疫与基质评分,统计免疫和基质评分与肺腺癌病理参数和预后的关系。LUAD亚型免疫/基质分数从高到低的排列顺序为Squamoid>Bronchioid>Magnoid。Stage III+IV患者的免疫评分和基质评分较低,但基质评分在统计学上不显著。低免疫评分组的患者中位总体生存时间较高分组更短（P=0.0322）。与基质评分较高的患者相比,基质评分较低的患者中位总生存期也较短,但差异无统计学意义。2、以免疫评分为基础进行比较,高分组744个基因上调,43个基因下调。在基质评分高低的组中,高评分组有2688个基因上调,253个基因下调。在高/低免疫评分组中提取的差异基因中,共84个差异基因在有显著的生存差异。3、将84个基因进行功能富集分析,数量最多的GO类别是免疫系统进程等,KEGG通路分析表明差异表达基因参与了原发性免疫缺陷等信号通路。PPI网络显示几个免疫反应关键基因占据了模块的中心,包括WDFY4、CD52、PLCB2等。4、下载并分析GEO数据库独立数据集中84例LUAD患者的基因表达数据。共有4个基因被证实与预后显著相关。5、qRT-PCR、Western Blot和IHC结果显示,在肺腺癌组织中DSE、EMR2、GFPT2表达较癌旁组织中的表达显著增高,FLT3显著低表达。6、TIMER数据库分析结果表明DSE表达与中性粒细胞细胞和树突状细胞的浸润呈正相关;EMR2表达与中性粒细胞细胞和树突状细胞的浸润呈正相关;FLT3表达与B细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞细胞和树突状细胞的浸润呈正相关;GFPT2表达与中性粒细胞细胞的浸润呈正相关。7、根据风险评分将整个队列分为高低风险组,风险得分越高,患者生存时间越短（P=0.0022）。通过整合四基因特征和其他临床特征得出的列线图C指数为0.722,具有较好的预测1年,3年和5年临床生存率的功效。8、TP53,TTN,和MUC16在高风险组中突变更为频繁,高风险组患者的TMB高于低风险组患者。结论:1、免疫评分与肺腺癌患者预后总生存以及亚型、分期等临床特征相关。2、以免疫评分为基础得出的预后相关差异表达基因参与了肺腺癌发展相关的生物学进程。3、DSE、EMR2、GFPT2、FLT3与肺腺癌患者的预后相关。基于免疫评分的基因标志物可作为肺腺癌预后分级的工具。
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