论文部分内容阅读
支气管哮喘是一种慢性炎症性气道疾病,具有可逆性气流阻塞、持续性气道高反应性和气道重塑的特点,临床表现包括喘息,呼吸急促,胸闷和/或咳嗽等,反复发作,并且可能随着时间推移逐渐恶化,导致呼吸衰竭。作为公共卫生问题,支气管哮喘在全球影响了超过3亿人,并给社会带来了沉重的经济负担。虽然支气管哮喘在全世界范围内已引起足够的重视,但迄今为止其治疗手段依然有限,以吸入糖皮质激素为主的治疗手段并不能让所有的支气管哮喘患者受益。大量关于支气管哮喘免疫机制的研究表明,CD4+T细胞(Th细胞)的分化及其分泌的各种炎症介质和细胞因子在支气管哮喘发病过程中扮演重要角色,大部分的支气管哮喘表型与Th1/Th2失衡、Treg/Th2失衡以及Th17过度表达相关。因此通过纠正免疫异常来治疗哮喘,成为可探索的一条道路。中医诊治支气管哮喘有着非常悠久的历史,《黄帝内经》中描述的“喘鸣”“喘喝“与本病的发作特点很相似。元代朱丹溪在《丹溪心法》中首次将“哮喘”作为独立的疾病立篇进行讨论。古人在漫长的临床实践经验中留下了诸多疗效确切的中药复方用于哮喘的治疗。如今科研工作者们借助现代科学技术,对这些复方进行深入探讨,为其作用机制做出科学的阐述。本研究选择射干麻黄汤为干预措施,从免疫方面来探讨其治疗哮喘的作用机制。目的:采用经典造模方法建立支气管哮喘小鼠模型,使用射干麻黄汤进行干预,同时与地塞米松干预进行对比,观察Th细胞亚群(Th2、Th17、Treg)分化及相关转录因子、细胞因子的变化,探索射干麻黄汤对支气管哮喘疾病免疫干预和气道炎症作用的机制。方法:选用6-8周龄、雌性、体重18-22g的BALB/c小鼠,采用经典OVA联合AL(OH)3致敏+激发的方式构建小鼠哮喘模型。致敏:分别于实验第0天,第6天和第13天每只小鼠腹腔注射0.5mL含50 μgOVA(GradeⅡ)及2mgAL(OH)3的致敏液。激发:从实验第21天起,将上述致敏后小鼠置于小鼠雾化吸入箱中,采用1%OVA(GradeⅡ)溶液8mL进行雾化吸入激发,每日1次,每次雾化60min,连续雾化2周。同时将实验小鼠简单随机分为5组:对照组、模型组、地塞米松组、低剂量中药组和高剂量中药组,每组10只。从实验第21天起,雾化前半小时给药干预。对照组正常饲养不做干预;模型组为腹腔注射生理盐水0.2mL;地塞米松组为腹腔注射地塞米松注射液1mg/kg、0.2mL;低剂量中药组为灌胃射干麻黄汤4.7g生药/kg、0.15mL;高剂量中药组为灌胃射干麻黄汤18.9g生药/kg、0.15mL。雾化2周后,24小时内各组小鼠在麻醉状态下行有创肺功能检测气道阻力,并收集小鼠肺脏、脾脏、淋巴结和血清。采用HE染色方法观察肺组织病理改变;免疫组化法观察肺组织中CD3+和CD4+T细胞的浸润;借助Milliplex(?)MAP细胞多因子检测试剂盒检测血清中IL-4、IL-17A、IL-23细胞因子的含量;运用流式细胞术检测小鼠脾脏和淋巴结中CD4+Foxp3+Treg细胞的表达情况;采用Western blot检测肺组织中P70s6k、P-P70s6k、Re1B、P65 蛋白表达量;采用 qRT-PCR检测 GATA-3、RORγ t 和T-bet转录因子的mRNA表达。结果:1.实验小鼠有创肺功能结果:模型组的气道阻力高于对照组(P<0.001),表明成功建立了哮喘小鼠模型。与模型组相比,低剂量中药组(P<0.05)和高剂量中药组(P<0.01)均可降低哮喘小鼠的气道阻力,并且高剂量中药组降低效果几乎与地塞米松组相似。2.肺组织HE染色结果:模型组的肺组织中炎症表现最明显,气管和血管周围有炎性细胞浸润,以及肺泡壁增厚和液体外渗。与模型组相比,低剂量中药组和高剂量中药组均能显著减少炎症细胞浸润和肺泡壁破坏,并且肺中嗜酸性粒细胞和粘液栓较少。3.肺组织免疫组化结果:与模型组相比,低剂量中药组和高剂量中药组均可降低哮喘小鼠肺组织中CD3+T细胞的浸润(P<0.01);同时高剂量中药组还表现出抑制CD4+T细胞浸润(P<0.01),而低剂量中药组中CD4+T细胞与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。地塞米松组与模型组相比,CD3+T细胞和CD4+T细胞浸润均减少(P<0.01)。4.Milliplex(?)MAP多因子检测血清结果:与对照组相比,OVA诱导的模型组增加了血清中IL-4,IL-17A和IL-23的产生(P<0.05)。高剂量中药组可减少血清中IL-4、IL-17A和IL-23的产生(P<0.05)。但是,低剂量中药组与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5.小鼠脾脏和淋巴结流式细胞术检测结果:OVA诱导的模型组中,哮喘小鼠脾脏和淋巴结中的CD4+Foxp3+Treg降低了(P<0.001)。和模型组相比,高剂量中药组增加了哮喘小鼠脾脏中CD4+Foxp3+Treg细胞的比例(P<0.01),另一方面,高剂量中药组亦增加了哮喘小鼠淋巴结中CD4+Foxp3+Treg细胞的频率(P<0.05)。但是低剂量中药组不管是在脾脏还是淋巴结中,与模型组比较均无统计学差异(P>0.05)。作为阳性对照的地塞米松组表现出较明显增加的脾脏和淋巴结中CD4+Foxp3+Treg细胞比例(P<0.001)。6.肺组织中mTOR和NF-κB途径相关蛋白的表达结果:高剂量中药组和低剂量中药组均抑制肺组织中P70s6k的表达(P<0.001)和磷酸化P70s6k(P-P70s6k)的表达(P<0.05)。与对照组相比,模型组中P65表达较高(P<0.001),RelB的表达亦升高(P<0.05)。和模型组相比,高剂量中药组均降低了RelB和P65的表达(P<0.05),低剂量中药组与模型组相比,对RelB表达的影响未表现出统计学差异(P>0.05)。地塞米松组对mTOR和NF-κB途径相关蛋白亦表现出抑制作用(P<0.05)。7.Th细胞相关转录因子mRNA表达结果:与对照组相比,模型组显示RORγt(P<0.001)和 GATA-3(P<0.01)的 mRNA 表达增加,而 T-bet 减少(P<0.001)。在用高剂量和低剂量的射干麻黄汤以及地塞米松处理后,小鼠肺组织中GATA-3和RORγ t的mRNA表达降低,T-bet的mRNA表达量增加(P<0.05)。结论:射干麻黄汤抑制Th2和Th17分化,促进CD4+Foxp3+Treg生成,通过调节哮喘小鼠异常的免疫内环境减轻支气管哮喘的气道高反应性和气道炎症。此外,射干麻黄汤还抑制mTOR和NF-κB活性减轻气道炎症反应。