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研究背景:G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)又称七次跨膜α螺旋受体,是已知人类基因组家庭中最大的膜蛋白。GPCR调节着几乎所有的人类已知的生理过程。GPCR的生物效应通常由G蛋白依赖的信号通路和非G蛋白依赖的信号通路引发。非G蛋白依赖的信号通路通常涉及到β-arrestin。β-arrestin的招募需要G蛋白偶联受体激酶(GRK)磷酸化受体。β-arrestin介导受体的脱敏和内吞,同时也独立激活下游很多信号蛋白。重要的是,很多治疗药物已经被证明可以特异性地激活G蛋白依赖的信号通路或非G蛋白依赖的信号通路。这样的配体引发偏向性的信号通路,被称为偏向性配体。了解GPCR偏向性信号的作用机制有助于设计特异性更强、副作用更低的药物,对于新型药物的研发具有重大意义。最近发表的多种GPCR受体与其配体的复合物晶体结构和相关的生化研究揭示不同的偏向性配体引发或者稳定不同的GPCR的构象。然而目前对于不同配体激活GPCR从而特异性引发G蛋白或β-arrestin招募并或产生相应信号通路的机制仍需要进一步研究。血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型(Angiotensin Ⅱ receptor type 1)属于GPCR中视紫红质样受体肽能家族,主要是通过偶联Gq蛋白激活磷脂酶C,产生胞内钙信号。AT1R调节包括动脉血压、口渴、电解质和水平衡、荷尔蒙分泌和肾代谢在内的多项生理功能,是一个治疗各种心血管疾病,如高血压、心肌肥厚、心力衰竭等的重要药物靶点。AT1R拮抗剂(Angiotensin receptor blocker,ARB)目前已经被广泛地应用高血压的治疗,另外其对心血管器官损伤的修复也有一定的益处。最近的研究表明,AT1R-β-arrestin信号通路的激活可以显著增强心肌收缩活力、降低心肌细胞凋亡、有效改善心室功能、减少心肌缺血、降低血压。因此,AT1R-β-arrestin信号通路提供了 ARB之外的另一种心血管疾病靶向治疗选择。然而β-arrestin包括两种亚型β-arrestin 1和β-arrestin2,最新的研究表明,虽然β-arrestin1和β-arrestin2具有高度的同源性,但是二者可以介导不同的GPCR功能,呈现出一定的功能差异性。因此不同的偏向性配体可能通过引发GPCR特异性的构象变化,对β-arrestin的亚型进行差异性的招募,从而引发偏向性信号通路。研究目的:通过对AT1R下游β-arrestin信号通路的研究发现β-arrestinl与β-arrestin2的偏向性配体,并进一步明确偏向性配体激活AT1R从而引发β-arrestin亚型偏向性信号通路的分子机制。研究方法:利用 SLIC(Sequence and Ligase Independent Cloning)的方法相构建关实验质粒;通过生物发光共振能量转移实验(Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET)检测AT1R配体的偏向性;利用AT1R胞内环的不同位置插入FlAsH探针(CCPGCC)的质粒检测不同偏向性配体刺激引发AT1R的胞内环构象变化;模拟不同配体与AT1R的相互作用并预测偏向性相关作用位点,设计位点突变对偏向性进行验证。研究结果:通过对配体筛选我们发现了对AT1R-β-arrestin1与AT1R-β-arrestin2偏向性较强的配体。FlAsH探针的研究结果表明不同β-arrestin亚型偏向性配体,可以引发AT1R胞内环尤其是ICL2和ICL3的不同构象变化模式,而这种变化可以被β-arrestin所识别并进而引发β-arrestin亚型的选择偏向性,AngⅡ的1/5/8位在AT1R的β-arrestin偏向性信号中起到关键作用。结论:本研究发现了 AT1R下游的β-arrestin1/2亚型偏向性,并初步阐明了不同偏向性配体刺激AT1R引发β-arrestin亚型偏向性信号通路的分子机制。