论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,临床表现主要有静止性震颤、肌僵直、运动减少和姿势反射障碍等症状。PD的神经病理学基础是黑质致密带(substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性脱失以及由此而导致的纹状体DA含量降低。PD的病因目前尚未完全明了,与遗传因素、环境因素、氧化应激、兴奋性毒素、自身免疫、黑质(substantia nigra, SN)铁聚积和细胞凋亡等多种因素有关。PD患者的中脑SNpc有大量的激活的小胶质细胞,这些激活的小胶质细胞和残存的DA能神经元又有大量的铁沉积,然而小胶质细胞激活和铁聚积之间的关系尚未阐明。乳铁蛋白(lactoferrin, Lf)是一种铁结合性糖蛋白,属于转铁蛋白家族成员之一,由许多外分泌腺分泌,存在于人类和其他哺乳动物的泪液、唾液、乳汁和嗜中性粒细胞中。乳铁蛋白受体(lactoferrin receptor, LfR)广泛存在于人体内的不同组织和细胞类型中,其作用是通过受体介导的内吞参与Lf内化。Lf可以结合转运三价铁离子,是铁在机体内代谢及转运的关键载体。Lf还具有广泛的生物学功能：抗氧化应激,抗癌,调控免疫炎症反应等,可能与其铁结合特性无关。在体内Lf主要以两种形式存在：不含铁形式(apo-lactoferrin, apo-Lf)和铁饱和形式(holo-lactoferrin, holo-Lf)。在脑内只有激活的小胶质细胞合成释放Lf,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)模型小鼠中Lf mRNA的表达水平升高。LfR主要在神经元上表达,脑组织染色发现PD患者中脑的神经元和微血管中LfR反应性表达增加,提示Lf/LfR与PD铁聚积和神经元进行性退化之间有一定关联性。本研究应用原代培养的大鼠小胶质细胞、腹侧中脑神经元及神经毒素MPTP制备的PD小鼠模型,采用酶联免疫吸附实验、实时荧光定量PCR、流式细胞仪技术、免疫荧光、免疫印迹、高效液相色谱法、激光共聚焦扫描技术等多项研究方法,探讨了铁对激活的小胶质细胞合成释放Lf的影响以及Lf对神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)损伤的腹侧中脑神经元及MPTP诱导的PD模型小鼠发挥保护作用的可能机制。结果如下：1.100μmol/L MPP+或800ng/ml的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理原代培养的小胶质细胞24h,Lf的释放量显著增加(P<0.05)。100μmol/L的枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate, FAC)预处理12h可显著增加其释放量,差别有统计学意义(P<0.05)。2.100μmol/L FAC预孵育12h后,分别加入100μmol/L MPP+或800ng/ml LPS处理24h,小胶质细胞中Lf mRNA的表达明显升高,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。3.100μmol/L MPP+处理原代培养的VM神经元24h后,细胞线粒体跨膜电位差(mitochondrial transmembrane potential,△Ψm)明显降低,与正常对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf预处理4h后,可明显拮抗MPP+引起的△Ψm降低(P<0.05)。4.100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf处理原代培养的VM神经元24h, LfR的蛋白表达水平显著增高,差别有统计学意义(P<0.05)。5.LfR抗体封闭1h可以明显阻断Lf的神经保护作用(P<0.05)。6.100μmol/L MPP+处理原代培养的VM神经元24h后,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)蛋白水平下调,与正常对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)；100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf预处理后,可明显拮抗MPP+引起的SOD蛋白水平下调,与单纯MPP+组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。7.100μmol/L MPP+处理原代培养的VM神经元24h后,细胞内Bcl-2蛋白水平下调,与正常对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)；而100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf预处理后,可明显拮抗MPP+引起的Bcl-2蛋白水平下调,Bcl-2/Bax比值升高,与单纯MPP+组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。8.100ng/ml apo-Lf处理后可明显降低原代培养的VM神经元内可变铁池(labile iron pool, LIP)的水平,差别有统计学意义(P<0.05),而holo-Lf处理后未检测到此变化。9. MPTP可明显减少C57BL/6小鼠黑质中酪氨酸羟化酶免疫阳性(TH-IR)神经元数目,apo-Lf预保护可显著增加TH-IR神经元数目(P<0.05)。10.Lf预保护可明显对抗MPTP对小鼠纹状体DA含量的降低作用,与正常对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明,激活的小胶质细胞可合成释放大量的Lf,这一过程可以被细胞内的高铁状态增强。在原代培养的腹侧中脑神经元中,Lf可明显拮抗MPP+引起的细胞△Ψm的降低,上调SOD和抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平,从而发挥抗氧化应激和抗凋亡的作用；apo-Lf还具有铁螫合能力,从而对抗MPP+的损伤发挥神经保护作用。MPTP诱导的PD模型小鼠中TH-IR神经元数目显著减少,DA及其代谢产物DOPAC、HVA的含量明显降低,而经Lf预处理以后可明显拮抗上述变化。本实验通过研究Lf合成释放的影响因素及其神经保护作用,为PD的发病和防治提供了实验依据。