研究背景当前,慢性创面在临床的治疗效果仍然不理想,慢性创面的医疗费用也急剧增加,使创面治疗相关的经济压力愈加沉重。常见的导致或者合并慢性创面的疾病包括糖尿病、压力性溃疡、放疗后皮损、周围血管病变以及静脉瘀血类病变等,这些疾病具有不同的基础疾病类型、年龄性别分布,其慢性创面的病理生理环境也不尽相同。给临床治疗工作带来了很大的挑战。糖尿病患者和肥胖者是慢性创面的高危人群,由于高糖和游离脂肪酸的长期影响,导致各种组织出现慢性炎症状态,慢性炎症是糖尿病慢性创面的一个重要特征。在实际临床治疗工作中,除去针对病因的治疗外,随着我们对创面的微环境的研究进一步深入,我们发现这些慢性创面都存在血管的损伤,创面存在供氧受损而氧需求量增高的缺氧状态。和慢性炎症一样,缺血缺氧也是慢性创面重要的特征和干预方向。糖尿病小鼠模型被广泛应用与糖尿病创面的研究,但是对于小鼠糖尿病创面免疫细胞的具体基因谱系并未得到较好的表征,现有的针对糖尿病创面模型的研究也大多局限于单一观察时间的结果。并不能很全面的展示创面愈合过程中的免疫细胞的时序性变化。单细胞测序是近年来出现并迅速发展的一项技术。它提供了一种对特定环境中的细胞群进行分类和功能研究的方法,不受以往经验所可能产生的偏见的影响,能够较好的表征细胞的变化,并且在发现新的稀有细胞及细胞的特异性状态方面具有很好的潜力。这项技术已在其他领域的细胞谱系表征及细胞发育分化研究方面成为了重要的技术助力。针对于慢性创面存在的缺血缺氧及慢性炎症因素,除外对于原发疾病的治疗及一般的对症支持治疗外,干细胞治疗是目前备受瞩目的发展方向。干细胞由于其特有的自我更新和多向分化能力成为医学领域的重要突破点,关于包括诱导多能干细胞、间充质干细胞,表皮干细胞、脂肪干细胞等在创面愈合的基础研究中都有了一定的进展。但目前对于干细胞的治疗的安全性和伦理问题仍然存在一定的争议。在我国尚未能大规模开展相关工作。外泌体是磷脂双层膜封闭的生物实体,存在于广泛的生理液体中。外泌体的分泌可见于各种类型的细胞,并能够携带来自其母细胞的重要生物分子。近年来随着外泌体研究的进展,干细胞来源的外泌体作为干细胞治疗的替代手段或补充手段,能够避免干细胞治疗中的安全风险,极大提升了干细胞使用的安全性并拓宽了干细胞的应用渠道。研究目的本研究旨在绘制糖尿病小鼠模型中免疫细胞的总体状态及特征谱系,通过时间序列的方式,线性且连续的表征免疫细胞群体之间的分布差异、基因差异及可能的分化差异。利用小鼠缺血性创面模型,研究表皮干细胞来源的外泌体对创面愈合及巨噬细胞功能和极化的影响。通过分析糖尿病创面微环境的特殊细胞群的基因表达差异,以及外泌体对缺血创面的巨噬细胞极化的差异影响机制,提供针对慢性创面中高糖及缺血两种致病因素可能的治疗思路和干预靶点。研究方法在第一部分中使用链脲佐菌素（STZ）构建糖尿病小鼠模型,并制作全层皮肤缺损创面,以1,3,5,7天为时间窗口进行取样,酶消化法制备创面组织单细胞悬液并通过流式细胞术分选出CD45阳性的免疫相关细胞。对分选后的细胞进行单细胞测序分析及数据可视化。在第二部分中我们构建了小鼠背部双蒂皮瓣缺血创面模型,超速离心法提取原代表皮干细胞来源的外泌体,通过Western Blot、流式细胞术在体外检测其对巨噬细胞功能和极化的影响。在体内实验部分通过创面拍照,图像软件分析创面愈合率,激光散斑血流成像系统及Western blot实验检测了外泌体干预后缺血创面愈合情况、血流改善情况及创缘巨噬细胞极化的影响,并通过蛋白质组学鉴定了外泌体内容物及其对巨噬细胞极化影响的相关机制。研究结果我们对从野生型和STZ诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠的创面组织中收集的CD45+细胞进行了单细胞测序。通过排除低质量的细胞,并对获得的样本的单细胞数据进行标准化处理以消除批次效应,一共获得9240个细胞的数据。根据其基因表达特征及过滤低质量细胞后共鉴定出17群细胞,包括4个中性粒细胞群,2个单核细胞群,3群巨噬细胞,2群DC细胞,1群NK细胞,1群T细胞,1群肥大细胞,1群成纤维细胞,和1群在对照组（急性创面）中数量占优势的未曾描述过的表达破骨细胞标记基因的巨噬细胞。两组之间各群免疫细胞存在数量分布,基因差异分布的时序性变化,差异高峰出现在第5天。两组的免疫细胞在炎症反应,防御机制,细胞代谢模式,血管形成等多方面存在显著差异。而特殊的表达破骨细胞标记的巨噬细胞主要不参与炎症过程,可能通过平衡组织平衡、组织重塑和细胞外基质中的胶原蛋白代谢参与创面愈合过程。小鼠缺血创面和自身对照的急性创面相比出现延迟愈合的表现,同时表皮和真皮层的厚度变薄,通过激光散斑血流仪检测发现缺血创面较对照组创面的血流信号减低。表皮干细胞来源的外泌体能够在体外促进巨噬细胞的增殖和迁移。在巨噬细胞极化实验中,应用外泌体干预后的M2型巨噬细胞标记物Arg1升高。外泌体干预小鼠缺血性创面后,创面愈合速率提高,同时外泌体干预的缺血创面的血流信号较未干预的缺血创面显著升高。干预后创面的M2型巨噬细胞标记蛋白Arg1升高,M1型巨噬细胞标记物iNOS降低。在蛋白质组学检测中,外泌体干预的M1型巨噬细胞表达的炎症相关的蛋白包括白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）降低,同时多种差异蛋白提示M1巨噬细胞极化的重要通路NF-κB受到抑制。M2型巨噬细胞在干预后的差异蛋白变化富集在代谢及坏死性凋亡、细胞因子结合等方面,并出现了许多与STAT6相关信号通路的差异蛋白。研究结论糖尿病小鼠创面模型中免疫细胞的群体变化存在显著的时序性差异,我们对创面相关免疫细胞群在不同时期的数量、基因表达及功能变化上进行了表征,绘制了小鼠糖尿病创面免疫细胞的动态变化谱系,发现了一群先前未在皮肤创面领域表征过的具有破骨细胞相关基因的巨噬细胞群体,并提出其促进创面愈合的潜在机制。本研究便于更清晰的认识创面愈合过程中免疫细胞的基因表达情况,对糖尿病创面愈合的免疫细胞相关标记基因和调控机制的研究提供重要参考。本研究发现表皮干细胞来源的外泌体能够促进小鼠缺血性创面的愈合并改善创面周围的血流状态,在体外可促进巨噬细胞的增殖和迁移并促进M2型巨噬细胞细胞极化。蛋白质组学分析显示,表皮干细胞来源的外泌体可能通过抑制NF-KB信号通路抑制M1型巨噬细胞的极化,同时促进STAT6相关信号通路进而促进M2型巨噬细胞的极化。为表皮干细胞外泌体在创面的应用提供新的证据和理论基础,并为寻找慢性创面中针对缺血因素下免疫细胞的参与靶点提供新的启示。