基于高内涵成像与智能识别的DNA损伤评价方法及药物筛选研究

来源 :浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:stefanie456
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DNA损伤即DNA物理状态或化学结构异常,它是癌症、衰老相关疾病的重要病理环节之一,也是紫外/电离辐射、化疗药物等导致机体细胞损伤的重要因素。因此,寻找发现能减少DNA损伤发生或促进DNA损伤修复的活性化合物,已成为药物筛选领域的热点。然而,现有的DNA损伤评价方法大多依赖于凝胶电泳、放射性标记等常规分析方法,存在通量低、灵敏度不足等问题。随着仪器分析技术的进步,以显微成像结合荧光标记为特点的高内涵成像技术为准确分析细胞核内DNA损伤程度提供了可能。为了实现DNA损伤程度自动判别并将其实际应用于高通量药物筛选,需要解决细胞模型构建、成像方法优化、图像智能识别、先导化合物确认与机制验证等系列问题。本文构建了使用荧光蛋白标记p53结合蛋白1(p53 binding protein 1,53BP1)的细胞系,通过损伤后核内53BP1焦点(foci)来定量DNA损伤程度,实现了单细胞水平DNA损伤图像的高通量获取,并构建了基于深度学习的DNA损伤图像智能识别方法。相关图像获取和分析方法为筛选发现抗DNA损伤药物提供了可行的技术手段。针对电离辐射致细胞DNA损伤、化疗药物多柔比星(doxorubicin,DOX)致心肌细胞DNA损伤两类情况,研究建立了3种DNA损伤评价新模型,从包含315个中药成分的化合物库中筛选发现了8个活性化合物,并进一步探究了活性化合物异甘草素(isoliquiritigenin,ISL)的心肌保护药效及其作用机制。论文主要内容及其学术贡献如下:1.建立了基于深度学习的DNA损伤图像分析方法(Foci Net),通过它实现了电离辐射下单细胞水平DNA损伤状态的准确识别,并将其应用于DNA损伤调节剂的筛选。首先构建了稳定表达荧光蛋白-53BP1融合蛋白的He La细胞系,用于标记细胞核内foci形成,通过优化成像参数、辐射剂量、阳性化合物浓度等,建立了辐照诱导的DNA损伤高内涵成像方法,并实现了基于化合物库的高通量筛选。针对5000余张双色荧光foci图像处理问题,人工注释了6000张单细胞图像用于训练分类网络,构建了以U-Net和VGG-19神经网络为核心的深度学习模型—Foci Net。Foci Net可通过基于U-Net的模块实现图像分割,随后通过基于VGG-19的模块判定各个细胞DNA损伤状态,从而评价细胞群的DNA损伤程度。研究结果表明,Foci Net对foci阳性细胞、foci阴性细胞、无信号细胞这三种细胞的分类准确率达到99.02%,能准确反映DNA损伤程度随辐照剂量、阳性化合物浓度的变化规律,在跨不同成像平台的通用性等方面亦优于传统的foci图像阈值分析方法。运用该方法,从化合物库中筛选发现了3个活性化合物(吴茱萸碱、草质素和ISL)。彗星实验表明其中的ISL减少了辐照引起的DNA双链断裂。2.在上述方法基础上,进一步针对蒽环类药物心脏毒性问题,建立了DOX致心肌细胞DNA损伤评价方法,并开展了抗DOX心脏毒性保护剂的高通量筛选。首先构建了稳定表达荧光蛋白-53BP1融合蛋白的H9c2心肌细胞系;通过凝胶电泳(彗星实验)发现DOX刺激下H9c2细胞双链断裂程度增加、Western Blot发现γ-H2AX增加,提示DOX能诱导心肌细胞DNA损伤。进一步优化成像参数、DOX处理时间等,建立了高内涵成像分析方法。该方法能有效反映阳性化合物右雷佐生、白藜芦醇对DOX损伤的心肌细胞的保护作用。运用该方法,筛选发现12个潜在活性化合物可能减少DOX诱导的DNA损伤,经验证后发现其中6个化合物(山柰酚、隐绿原酸、野黄芩苷、槲皮素、山柰素、ISL)能有效减轻DOX所致心肌细胞损伤。3.为进一步验证上述筛选结果,构建了微图案化培养的乳鼠原代心肌细胞,以便在类生理心肌排列、心肌持续搏动的仿生条件下评价化合物对DOX损伤的心肌细胞的保护作用。通过3D打印技术优化微图案化水凝胶基底,获得了具有整齐排列、较高肌丝结构成熟度的仿生培养心肌细胞。显微成像和分析表明其收缩频率约为(32.67±8.07)rpm,高于传统培养的(19.67±4.27)rpm;钙瞬变测试表明其存在稳定的电冲动传播;与在体心肌在收缩、电冲动传播功能方面具有较好相关性。在此基础上,构建了DOX致微图案化原代心肌细胞DNA损伤模型,通过Foci Net智能识别图像发现,阳性化合物右雷佐生组的恢复率从传统培养时的(61.96±6.51)%提升到微图案化培养时的(94.07±5.56)%,提示该DOX致微图案化原代心肌细胞DNA损伤模型能更好地评价化合物的抗DOX致心肌损伤药效。进一步验证了筛选得到的化合物,发现在该模型上ISL能缓解DOX诱导的53BP1 foci形成和收缩频率下降。4.采用体外细胞与整体动物模型,验证了活性化合物ISL抗DOX心肌损伤的药效。首先,在H9c2心肌细胞上,发现ISL剂量依赖性地抑制DOX诱导的53BP1 foci形成;彗星实验和Western Blot实验发现它减少DOX诱导的DNA双链断裂(P<0.01)和DNA损伤标志物γ-H2AX(P<0.01);这些进一步提示ISL减少DOX致H9c2心肌细胞DNA损伤。随后,通过噻唑蓝法检测细胞活力,发光法检测细胞ATP水平、荧光成像定量检测凋亡细胞比例、Western Blot检测蛋白表达,研究ISL的心肌细胞保护作用。结果表明,与DOX处理组相比,ISL剂量依赖性地提高细胞活力、ATP水平,剂量依赖性地降低凋亡细胞比例,降低了促凋亡相关蛋白BAX和Caspase 3的表达。在DOX致小鼠心肌损伤模型上发现,ISL改善了DOX诱导的心功能下降、心肌肌节解体和线粒体肿胀。最后,通过自由基清除实验测定ISL抗氧化活性,通过荧光成像测定细胞内活性氧水平和过氧亚硝基阴离子水平,通过Western Blot测定HO-1和拓扑异构酶II表达量,探讨ISL的DNA保护机制。结果表明,在体外ISL具备自由基清除作用;H9c2细胞上,相比于DOX处理组,ISL组活性氧和过氧亚硝基阴离子水平降低,HO-1表达增加,拓扑异构酶II减少,提示ISL抗DOX诱导DNA损伤的保护作用可能与抑制氧化应激、减少拓扑异构酶Ⅱ有关。
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