小球藻病毒来源的启动子具有在原核生物与真核生物都能启动基因转录的特点,本实验利用来自小球藻病毒且在大肠杆菌中具有强调控活性的启动子序列来构建莱茵衣藻转化载体。将博莱霉素抗性基因sh ble与绿色荧光蛋白基因gfp融合成的ble-gfp筛选标记-报告基因融合基因置于小球藻病毒启动子控制下,同时构建无启动子和由内源rbcS2启动子控制的正负对照转化载体。上述转化载体经电击导入胞壁缺陷型莱茵衣藻藻株Chlamydomonas reinhardtii cc503后分别用7.5μg/mL和4μg/mL博莱霉素进行平板和液体筛选,得到一系列sh ble抗性藻落;而无启动子的对照转化载体没得到任何抗性藻落。经PCR扩增发现小球藻病毒来源的N63、N80、N99、N35启动子控制下的ble-gfp融合基因插入了sh ble抗性藻细胞基因组。用qRT-PCR方法检测了病毒启动子和rbcS2启动子控制的sh ble转录文本丰度,结果表明小球藻病毒启动子和rbcS2启动子一样在莱茵衣藻中具有正常的启动活性。将上述筛选到的启动活性较强的启动子来构建含有gpd1基因的重组质粒,同样用电击转化法转化进莱茵衣藻细胞中,用PCR技术检测插入到莱茵衣藻基因组中的片段,并用尼罗红染色法检测含gpd1基因的莱茵衣藻转化株,结果表明莱茵衣藻转化株的油脂含量确实有所提升,具体实验结果如下所示:1.用小球藻病毒来源的启动子构建pBR11-N35、pBR11-N63、pBR11-N80、pBR11-N83、pBR11-N96和pBR11-N99质粒,构建正、负对照质粒pGO24、pGO25。将这些构建好的质粒用电击转化法转进莱茵衣藻细胞中,用7.5μg/mL的博来霉素抗性筛选阳性藻株,结果发现pBR11-N35、pBR11-N63、pBR11-N80和pBR11-N99这四种转化株均能在有博来霉素抗性的平板上生长。2.通过PCR检测,我们发现在小球藻病毒来源启动子N35、N63、N80、N99控制下的sh ble抗性选择标记基因,GFP报告基因均插入到了莱茵衣藻的基因组里,通过qRT-PCR方法检测病毒启动子和rbcS2启动子控制的sh ble转录文本丰度,发现了N63和N35启动子相对于rbcS2相比,其mRNA的表达量均上调,其中N63的活性最强可以达到rbcS2启动子的1.78倍。说明小球藻病毒启动子和rbcS2启动子一样在莱茵衣藻中具有正常启动活性。3.用N63启动子构建含有gpd1基因的质粒,通过电击转化法转化进莱茵衣藻细胞中,用7.5μg/mL的博来霉素抗性筛选阳性藻株,发现pB-N63-GPD1和pB-RBCS2-GPD1转化株均能在博来霉素抗性的培养基中生长。4.提取转化藻株的基因组,进行PCR检测,pB-N63-GPD1和pB-RBCS2-GPD1转化株均能扩增出目的基因。5.将尼罗红染色法进行优化,发现莱茵衣藻细胞在尼罗红-丙酮的终浓度为0.3mg/mL,室温下避光染色20 min的条件下油脂滴较为清晰。6.通过尼罗红染色法和多功能酶标仪检测发现莱茵衣藻转化株的油脂含量显著高于野生型藻株CC503(p<0.05),转化藻株的含量比野生型提高了1.23倍。