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烟碱类杀虫剂吡虫啉(imidacloprid,IMI)的长期大量使用不仅增加了其在环境中的残留量,还可能威胁人类的健康。微生物代谢是农药在环境中代谢的主要方式之一。目前报道的微生物代谢IMI的主要途径为羟基化途径(hydroxylation)和硝基还原途径(nitroreduction)。在IMI的羟基化途径中生成的5-羟基吡虫啉(5-hydroxy IMI)的杀虫活性较IMI低,但5-hydroxy IMI水解产物烯式吡虫啉(olefin IMI)的杀虫活性则是IMI的19倍;在IMI硝基还原产物中,胍基吡虫啉(guanidine IMI)对哺乳动物的毒性却远高于IMI。开展IMI代谢途径的调节研究对于减少IMI的使用量、降低其在环境中的残留有重要指导作用。作者所在实验室筛选到一株IMI羟基化活性最高的假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica CGMCC 6648。本文继续开展了该菌株的IMI代谢途径研究,P.indica CGMCC 6648在以葡萄糖和丙酮酸钠作为共代谢基质时,其代谢IMI的能力和代谢途径不同:以葡萄糖为共代谢基质时,IMI的代谢途径为羟基化,未检测到nitroso IMI的生成;预培养18 h的静息细胞的转化液中,5-hydroxy IMI的生成量达260.96 mg/L,olefin IMI的生成量为7.78 mg/L;以丙酮酸钠为共代谢基质时,CGMCC 6648预培养18 h,其经由IMI羟基化途径生成的5-hydroxy IMI为152.93 mg/L,olefin IMI为42.90 mg/L,并且在不同的预培养时间下,均有nitroso IMI的生成,含量为 0.48 mg/L 至 2.22mg/L。本实验室已完成P.indica CGMCC 6648的全基因组测序,本研究从中搜索单加氧酶基因,共找到了 13个单加氧酶基因和1个乙醛氧化酶基因,分别是0479(aspartyl-asparaginyl beta-hydroxylase)、0642(2-octaprenyl-3-methyl-6-methoxy-l、4-benzoquinol hydroxylase)、0826(alkanal monooxygenase)、0864(UbiH/UbiF/VisC/COQ6 family ubiquinone biosynthesis hydroxylase)、1219(Putative monooxygenase2-polyprenyl-6-methoxyphenol hydroxylase)、1812(molybdopterin-binding aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase,硝基还原酶)、2337(vanillate monooxygenase)、2450(phenylalanine 4-monooxygenase)、2490(phenol hydroxylase)、3100(2-octaprenyl-3-methyl-6-methoxy-l、4-benzoquinol hydroxylase)、3337(2-octaprenyl-6-methoxyphenyl hydroxylase)、3675(antibiotic biosynthesis monooxygenase)、3825(nitronate monooxygenase)、kynurenine-3-monooxygenase(已由本实验室的师姐进行了表达)。本文对上述12个单加氧酶基因和1个乙醛氧化酶基因进行了克隆和表达研究。将目的片段连接到表达载体pET28a上,并导入表达菌株Escherichia coli Rosetta中进行异源表达;然后将重组菌株制备成静息细胞(resting cells),在以丙酮酸钠为共代谢基质(co-substrate)的磷酸盐缓冲液中降解IMI 4 d,采用HPLC法分析底物和产物的变化。HPLC结果显示重组0864、2450、和0479基因的Rosetta菌株的IMI羟基化活性较对照组(空载质粒)Rosetta分别提高了 1.27、1.49、1.75倍。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,2450蛋白(苯丙氨酸单加氧酶)具有较好的可溶性,因而继续将含2450表达蛋白的Rosetta细胞破碎液转化IMI,HPLC检测发现其仍有IMI羟基化活性。进一步采用镍柱纯化法纯化2450蛋白,以苯丙氨酸作为底物检测其有苯丙氨酸单加氧酶活性。以IMI为底物,未检测到5-hydroxy IMI的生成。苯丙氨酸羟化酶的羟化反应需要还原性喋呤辅因子和铁离子,只添加Fe2+的反应液中也能检测到5-hydroxy IMI的生成,表明金属离子参与了 IMI的羟基化。。作者所在实验室前期发现IMI羟基化需要NAD(P)H作为辅因子且NADPH对IMI羟基化的促进作用是NADH的2倍。除磷酸戊糖途径中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶可再生NADPH外,苹果酸-丙酮酸转换途径中的MaeA、MaeB也参与NADPH的再生。本文采用Red/ET同源重组系统对E.coli DH10B中的maeA、maeB进行单敲除和双敲除,并用基因敲除菌株进行IMI的降解能力测试。结果表明单敲除菌株ΔmaeA、ΔmaeB的IMI的降解量不受基因敲除的影响,而双敲除菌株的IMI降解量由对照组的 24.2 mg/L 减少至 11.9 mg/L(p<0.05)。总之,本论文开展了假黄单胞菌CGMCC 6648对世界第一大杀虫剂品种吡虫啉的代谢研究,发现其存在IMI硝基还原途径;从CGMCC 6648的基因组中搜索到了 13个单加氧酶基因和一个乙醛氧化酶基因,对其中12个单加氧酶基因进行了克隆和表达以及IMI羟基化活性分析。论文的探索工作对于了解IMI的微生物代谢机制有重要价值。