山药蛋白质分离纯化及抗氧化活性研究

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山药为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)植物薯蓣的块茎。山药既是食用的滋补保健品,又是常用的药材。其性平,味甘,能健脾止泻、补肺益肾,在我国历代药典中均有详细记载。国内学者的研究主要集中在对山药的种植技术、山药多糖提取以及活性、山药深加工等领域。而对于国内山药品种的蛋白质研究,一直未见报道。故本文以国内山药品种为原料,开展山药蛋白质的提取、分离纯化与体外抗氧化活性的一系列研究。首先,本研究对河南地区种植的六种经典山药品种:太谷山药、铁棍山药、冀城山药、晋城1号山药、白玉山药的基本化学成分进行了测定。得出铁棍山药水分含量最低,为79.01%,并且总氮含量与可溶性蛋白质含量均最高,分别为19.91%和3.09%。确定了以铁棍山药——这一珍贵的药食兼用的良药佳肴作为原料,进行后续的蛋白质实验研究。其次,对山药蛋白质的提取条件进行优化。选择提取时间、液料比、pH值及提取次数4个因素分别进行单因素实验,比较山药蛋白质的得率。在单因素实验基础上,选择提取时间、液料比和pH值3个参数进行三因素三水平的Box-Behnken响应曲面实验,对此3个参数的实验组合进行优化。得出最优提取条件为时间67 min,液料比5.5 m1/g,pH为7.5。并且在预测的优化条件下进行3次验证试验,得到了蛋白质提取率为3.72%。经过优化后蛋白质提取率得到了很大程度的提高。再次,对山药蛋白质进行分离纯化。运用DEAE-纤维素-52阴离子交换柱色谱法对山药蛋白质粗提物进行初步分离。再利用葡聚糖G-100凝胶过滤柱色谱法对初步分离组分进一步纯化。得到山药蛋白质纯化产品P-1和P-2两个组分。P-1、P-2蛋白质含量分别为85.86%和81.62%;而它们的糖含量分别为7.72%和8.23%。P-1和P-2可能均为糖蛋白。通过SDS-PAGE电泳结果的观察,可以发现,铁棍山药蛋白质共有20、31、50和66 kDa四种分子量。通过氨基酸组成的测定,可知P-1和P-2均含有至少16中氨基酸,分别为天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、甘氨酸。在P-1和P-2之中,天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸的含量相对较高,为主要氨基酸。而P-1和P-2中均含有人体必需的8种氨基酸。最后,本章节运用化学方法分别测量分析了山药粗蛋白质及其纯化组分P-1和P-2的体外抗氧化活性。比较分析了粗蛋白质、P-1和P-2三者之间抗氧化活性的差异情况,结果表明,粗蛋白质、P-1和P-2均具有较高的抗氧化活性。其中,粗蛋白质的抗氧化比P-1和P-2具有更高的抗氧化性,这可能归因于粗蛋白质中含有活性较高的杂质,如多酚与黄酮类物质。而此类物质在蛋白质的DEAE-纤维素离子交换色谱和葡聚糖凝胶过滤色谱纯化中被去除。
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