研究背景非编码核糖核酸(ncRNA)在生命过程中所发挥的重要作用已经得到了广泛的重视和认可。ncRNA在活细胞中行使包括从遗传信息贮存、转运到生物化学反应催化的多种功能。MiRNA是动物和植物中存在的一类最小的功能ncRNA,通过与靶mRNA上特异的互补位点结合而在转录后水平抑制基因的表达。它们长度约为22个核苷酸左右,在结构和序列上没有共同的特点,一种生物有数百至上千个不同的miRNA,它们在生物发育的不同阶段、生物的不同组织以及不同细胞类型中具有不同的表达模式。一些miRNA在生物体中广泛表达,另一些miRNA显示出在组织细胞的不同发育期或不同组织类型的严格特异性模式表达。多个实验和临床分析证明miRNA可以调节癌基因和/或抑癌基因,从而发挥促癌或抑癌作用。在肿瘤中过表达的可以被看作“癌基因”,这些miRNA称作癌miRNA。最初的报道来自慢性淋巴细胞白血病的研究,后来很多国外及国内学者对miRNAs在肿瘤中的表达情况,及对肿瘤的发生、发展、分期、药物治疗和预后等方面开展了相关的研究工作。但是目前的文献中还没有对胃癌中miRNAs的表达情况及其靶基因进行系统的研究。目的应用miRNA基因芯片分析的方法,比较胃癌组织和癌旁组织中miRNAs的表达情况,找出有差异表达的miRNA,通过定量PCR的方法在更多的样本中验证某个具有显著差异的miRNA的表达情况;使用相关的数据分析软件预测其靶基因;为下一步研究该miRNA的靶基因及KEGG通路与胃癌的发生、发展和预后的相关性的研究奠定基础。方法1、收集7例经病理确诊为胃腺癌,及同个病人距离胃癌病灶5cm以上的癌旁组织,应用miRNA基因芯片(Illumina公司)分析miRNA表达,包括下列步骤提取总RNA、RNA的多聚腺苷酸化、双链cDNA合成与纯化、PCR扩增、芯片杂交及数据处理、并使用相关的数据分析软件,比较胃癌和癌旁组织中miRNAs的表达情况。2、从新鲜冰冻标本库中取出25对胃癌及癌旁标本提取总RNA,并逆转录成cDNA进行后续的实验。根据miRNA数据库和相关文献,查询人类miR-181a、miR-584的序列,设计引物,应用LNA(锁核苷酸)引物SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量PCR方法(Exiqon Universal)验证miR-181a、miR-584在25对胃癌及距离胃癌病灶5cm以上的癌旁组织的表达情况。3、使用相关的数据分析软件(miRanda和Targetscans)预测其靶基因,选择两个方法均预计的靶基因作为候选靶基因;采用KEGG通路数据库分析靶基因的KEGG通路。结果1、芯片分析显示与非癌组织相比,有9个差异表达(p<0.01),其中3个(HS-138,HS-153,HS-157)在胃癌组织中低表达,6个(hsa-miR-181a,hsa-miR-21,hsa-miR-21*,hsa-miR-27a,hsa-miR-584,hsa-miR-93)高表达。2、应用荧光定量PCR技术对25对胃癌及癌旁组织中miR-181a、miR-584的表达情况进行验证,其中在21例胃癌组织中miR-181a表现为高表达、13例胃癌组织中miR-584表现为高表达,但配对双侧t检验显示miR-181a有统计学意义上的高表达(p<0.05)。并将25对标本的性别、年龄、病理分型以及有无淋巴结转移与miR-181a在胃癌组织中的表达情况进行离散型分类计数资料的卡方检验后,发现miR-181a在胃癌组织中的高表达与标本有无淋巴结转移有明显的相关性(P=0.009<0.01),与年龄差异也有相关性(P=0.023<0.05),但是与性别和病理类型无相关性(P值分别为0.220和0.106)。3、预测miR-181a对应的靶基因61个,miR-181a靶基因参与了11个KEGG途径,包括了人类代谢途径、代谢作用、遗传信息处理、环境信息处理、细胞进程和有机体系等分子的相互作用和反应网络。结论1、本实验发现了在胃癌中有差异表达的miRNAs。2、通过应用荧光定量PCR技术验证了miR-181a胃癌中为高表达,并预测了miR-181a的靶基因和KEGG通路。