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目的:肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种侵犯上下运动神经元的神经系统变性疾病,临床表现为肌无力、肌萎缩及锥体束征等不同组合,起病后多数患者仅存活35年,最终多死于呼吸衰竭,其发病机制至今尚未阐明。前期基础研究发现健脾益肺方可能通过抑制小胶质细胞活化发挥抗神经炎症的作用,从而延缓疾病进展。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38-Mitogen-Activated Protein Kinase,p38MAPK）是MAPK家族主要成员之一,参与神经炎症反应,p38MAPK通路介导胶质细胞活化,在突变型SOD1转基因小鼠模型中发现,活性小胶质细胞和星形胶质细胞所致的神经炎症使运动神经元死亡。为探讨神经炎症及神经细胞凋亡在肌萎缩侧索硬化发病机制中的作用,本研究通过检测不同浓度健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠体重的变化,发病时间和生存期及运动功能的影响;用免疫荧光（immunofluorescence,IF）和蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）检测ALS小鼠脊髓磷酸化p38MAPK蛋白及炎症因子的表达;原位末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase-media-ted d UTP end-labeling,TUNEL）检测ALS小鼠脊髓神经细胞凋亡情况。从抗炎症及抗细胞凋亡保护神经元的角度解释健脾益肺对ALS小鼠的作用机制,为健脾益肺方治疗ALS提供更多实验依据。方法:1.实验动物hSOD1-G93A转基因小鼠,8周龄,共24只,按随机数字表分成4组,每组6只,即模型组、健脾益肺方低浓度组(2.86g·kg-1)、健脾益肺方中浓度组(5.72g·kg-1)、健脾益肺方高浓度组(11.44g·kg-1),同窝出生的普通野生型小鼠,8周龄,共6只,为正常对照组。模型组与正常组小鼠分别给予生理盐水,药物组予不同浓度的中药,每日灌胃1次。2.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠行为学的影响每周测定小鼠体重并记录;用weydt评分法来评估ALS小鼠的发病时间和生存期,用悬尾试验、牵引试验、疲劳转棒试验及跑台试验等来评估小鼠的运动功能。3.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠脊髓胶质细胞活化增生及p38蛋白核转移程度的影响终末期小鼠取材后,包埋、固定及切片后进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察,比较分析各组小鼠小胶质细胞活化标志物CD11b计数、星形胶质细胞活化标志物GFAP计数及p38、p-p38荧光强度核/浆比的差异。4.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠脊髓p38、p-p38、TNF-α、COX-2及iNOS蛋白表达的影响终末期小鼠取材后,用蛋白质免疫印迹法检测p38、p-p38、TNF-α、COX-2及iNOS等蛋白表达,用Image Lab显影成像并进行数据分析,比较分析各组小鼠蛋白表达差异。5.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠脊髓神经细胞凋亡的影响终末期小鼠取材后,用免疫荧光法检测各组小鼠腰段脊髓前角运动神经元标志物Neun的表达差异,用TUNEL检测不同组别小鼠脊髓细胞凋亡情况,显微镜观察拍照并计算各组细胞凋亡指数。结果:1.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠行为学的影响ALS小鼠体重变化结果表明,在第8-12周,模型组与药物组ALS小鼠体重基本稳定,体重变化无明显差异。从第13-14周开始,模型组与低浓度健脾益肺方组ALS小鼠体重开始缓慢下降,中高浓度健脾益肺方组体重基本稳定。从第15-16周开始,模型组与低浓度健脾益肺方组ALS小鼠体重迅速下降,中高浓度健脾益肺方组ALS小鼠体重开始缓慢下降,与模型组及低浓度健脾益肺方组ALS小鼠体重比较,中高浓度健脾益肺方组ALS小鼠体重下降程度较小,差异具有统计学意义。ALS小鼠发病时间及生存期结果提示,模型组小鼠发病时间快,生存期短。与模型组ALS小鼠比较,低浓度健脾益肺方组发病时间延长了3天,生存期延长了4天,但无统计学差异,中高浓度健脾益肺方组ALS小鼠发病时间分别延长了13与15天,生存期分别延长了11与17天,差异具有显著统计学意义。ALS小鼠运动功能结果提示,第9-14周,各组小鼠牵引试验及跑台试验掉落次数较平稳,无显著差异。从第15周开始,模型组ALS小鼠开始掉落次数增多,第16周开始低浓度健脾益肺方组ALS小鼠掉落次数开始增多,而中高浓度健脾益肺方组ALS小鼠掉落次数基本稳定,与模型组比较差异具有统计学意义。第17-18周开始,中高浓度健脾益肺方组ALS小鼠掉落次数开始增多,而模型组及低浓度健脾益肺方组ALS小鼠开始不耐受该实验,从20周开始中高浓度健脾益肺方组ALS小鼠亦不耐受该实验。2.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠脊髓胶质细胞增生及p38、p-p38蛋白核转移程度的影响研究结果提示,正常组的胶质细胞活化数量少,细胞胞体较小,突起和分支少,呈杆状。与正常组比较,模型组、低浓度组ALS小鼠胶质细胞激活数显著增多,细胞体积增多增粗,与模型组小鼠比较,中高浓度组ALS小鼠的胶质细胞激活数明显减少,其差异具有统计学意义。与正常组比较,模型组和低浓度组p38MAPK、p-p38MAPK荧光强度核浆比差异具有统计学意义（P<0.01）,提示模型组、低浓度组核转移程度高。与模型组比较,中高浓度组p38MAPK、p-p38MAPK荧光强度核浆比具有显著差异（P<0.01）,提示中高浓度中药组核转移程度较低。3.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠脊髓p38、p-p38及炎症因子表达的影响实验结果提示,在ALS小鼠脊髓发现有p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的沉积,与正常组比较,模型组和低浓度组p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达具有明显差异（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较,中高浓度组p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达具有显著差异（P<0.01）。与正常组比较,模型组、低浓度组COX-2、INOS蛋白表达有显著差异（P<0.05,P<0.01）,模型组TNF-α蛋白表达具有显著差异（P<0.01）。与模型组相比,中高浓度组COX-2、TNF-α、INOS蛋白表达有统计学差异（P<0.01）。提示不同浓度的健脾益肺方作用于ALS小鼠,其脊髓p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2、TNF-α及INOS蛋白表达随药物浓度的递减而呈递增趋势。4.健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠脊髓运动神经元及细胞凋亡的影响免疫荧光结果表明,与正常组比较,各组ALS小鼠脊髓前角可见神经元丢失情况,模型组与低浓度组神经元明显减少;与模型组比较,中高浓度健脾益肺方组神经元阳性细胞数明显增多。TUNEL实验结果提示,与正常组比较,模型组、低浓度组脊髓前角细胞凋亡数及其占细胞总数百分比明显增多,与模型组相比,中高浓度健脾益肺方组细胞凋亡数明显减少,凋亡细胞占细胞总数百分比显著减少,结果说明不同浓度的健脾益肺方作用于ALS转基因小鼠,脊髓前角细胞凋亡数及凋亡指数表达随药物浓度递增而减少,提示健脾益肺方以浓度依赖性抗细胞凋亡,保护神经元。结论:1.健脾益肺方能延缓ALS转基因小鼠体重下降,改善其运动功能,延长发病时间和生存期。2.ALS小鼠脊髓存在胶质细胞活化增生及p38MAPK、炎症因子蛋白沉积情况,健脾益肺方以药物浓度依赖性抑制小胶质细胞及星形胶质细胞的过度活化增生,下调p38MAPK、p-p38MAPK、TNF-α、COX-2及INOS蛋白的表达,提示健脾益肺方可能通过介导p38MAPK通路抑制p38MAPK蛋白磷酸化,减少胶质细胞的活化,调控TNF-α、COX-2、INOS炎症因子的表达,从而减轻神经炎症发挥神经保护作用。3.本研究中发现ALS小鼠脊髓前角存在神经元丢失、细胞凋亡的情况,健脾益肺方可能通过介导p38MAPK通路,抑制其磷酸化,从而抑制炎症介质的释放,减轻神经元损伤,起到抗细胞凋亡,保护神经元的作用。