论文部分内容阅读
禽腺病毒（Fowl adenoviruses,FAdVs）是引起禽类传染病的重要病原体,I型禽腺病毒分为5个亚群（A～E）,12种血清型（FAdV-1～8a和FAdV-8b～11）,其中C亚群4型（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）是感染我国家禽最主要血清型,在鸡群中的发病率和死亡率高。目前,对FAdV-4感染细胞的种类以及感染后血细胞的变化、细胞产生细胞因子特性、不同类型疫苗的免疫效果尚不清楚,本研究对实验室前期分离到的强毒株FAdV-4进行以下三个方面的研究。一、确定病毒感染雏鸡后的排毒时间,检测病毒感染对血液中白细胞数量的影响以及确定病毒体外感染细胞类型。首先,对15日龄SPF雏鸡按照5×105.5TCID50/只的剂量接种病毒,分别在24、36、54、72和96 h时通过泄殖腔拭子检测病毒的排毒以确定机体的感染时间。其次,当病毒体内感染72 h时,无菌采集雏鸡的血液,应用鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒分离外周血红细胞和白细胞,分别提取两种细胞DNA,应用PCR方法检测病毒的感染。然后,应用流式分离术计数10~6个血细胞中白细胞数量与比例。最后,病毒体外感染鸡肝细胞系（Leghorn male hepatocellular cells,LMH）、鸡成纤维细胞系（Chicken fibroblasts cells,DF-1）、鸡巨噬细胞系（Chicken macrophage-like cells,HD11）、鸡B淋巴细胞系（Chicken B lymphocyte cells,DT40）和鸡胚肾细胞（Chicken embryonic Kidney cells,CEK）,孵育3～5 d后提取细胞DNA,应用PCR检测病毒的感染。结果显示,接种病毒54 h以上即可以检测到排毒,感染雏鸡多在96～120 h（4～5 d）死亡;病毒不能感染DF-1、HD11和鸡的红细胞,可以感染DT40、LMH、CEK和鸡的白细胞。流式结果显示,相对于空白对照组,病毒感染组的白细胞数量提高了8.6倍,差异极其显著（P＜0.01）。二、探究病毒感染不同细胞产生细胞因子的种类和特点。首先,提取接种病毒72 h雏鸡白细胞的m RNA并反转录c DNA,应用RT-PCR检测颗粒酶A（Gzyms-A）、穿孔素（PFP）、IL-1β和Ii基因的表达。其次,应用RT-PCR检测病毒感染LMH细胞12、24和36 h后IFN-α和IFN-γ的表达量。最后,应用RT-PCR检测0.2和0.4 MOI病毒感染72 h后CEK细胞IFN-α和IFN-γ的表达量。结果显示,病毒感染72 h后,活化T细胞的细胞因子（Gzyms-A和PFP）、细胞因子（IL-1β）和抗原转运相关Ii基因表达量下降,分别是空白对照组的1/3、1/100、1/8和1/20,差异极显著（P＜0.01）。FAdV-4感染LMH细胞36 h之后IFN-α表达量提高了2倍,而IFN-γ在感染12、24和36 h后表达量分别提高了25、42和46倍,与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。0.2 MOI FAdV-4在感染CEK细胞72 h后,IFN-α和IFN-γ的表达量分别提高78和3200倍,0.4 MOI FAdV-4在感染CEK细胞72h后,IFN-α和IFN-γ的表达量分别提高85和3700倍,与对照组相比差异极显著（P＜0.01）。三、制备了尿囊液和CEK细胞的灭活疫苗并比对免疫效果。首先,制备病毒液,将病毒接种鸡胚制备尿囊液,同时将病毒感染CEK细胞,72 h后收集细胞上清获得细胞毒。其次,测定尿囊液和细胞液的TCID50,用终浓度为1.5‰的甲醛灭活后制备油乳灭活苗,检验疫苗外观、粘度、无菌和安全性。最后,用制备的疫苗接种雏鸡,二次免疫后每只雏鸡接种0.05 m L病毒,根据死亡雏鸡的数量计算疫苗的保护率。结果显示,尿囊液和细胞毒的毒力分别为106.56TCID50/0.1 m L和106.42TCID50/0.1 m L。制备的两种类型的疫苗经检验均合格。尿囊液和细胞液灭活苗的保护率分别为62.5%和37.5%。综上所述,本次研究发现高致病性FAdV-4毒株对细胞具有选择性,可以感染LMH、CEK、B淋巴细胞和鸡白细胞,不能感染DF-1、HD11和鸡红细胞,病毒感染后可以引起白细胞的升高;FAdV-4感染后不能上调活化T细胞的比例和数量,不能诱发有效T细胞的应答,病毒可以诱导LMH和CEK细胞IFN-α和IFN-γ的表达,尤其是CEK中细胞因子的表达,这说明肾脏是最主要的免疫器官;制备了FAdV-4尿囊液和CEK细胞液油乳灭活苗,保护率较低,分别为62.5%和37.5%。