多糖是动物、植物、海藻以及微生物中普遍存在的一类天然大分子物质,是生命有机体的主要组成部分。已有研究证实,多糖具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗血栓、抗凝血、降血糖、降血脂等多种生物学功能,现在研究最多的是多糖的免疫调节作用。多糖按照来源可分为植物多糖、真菌多糖、海藻多糖、动物多糖、细菌多糖五类,其中植物多糖因其来源广泛、效果确切且纯天然,已日益被人们所重视。大量试验证明,植物多糖具有广泛的生物活性,普遍存在免疫调节作用。本研究在国内外学者对植物多糖研究的基础上,从资源广泛的紫花苜蓿中提取了水溶性苜蓿多糖(Water Soluble Alfalfa Polysaccharides, WSAP),提取试验分别在工厂和实验室不同的条件下进行,并通过日粮中添加和体外淋巴细胞培养就WSAP对肉仔鸡生长性能和免疫功能的影响进行了研究。试验一:水溶性苜蓿多糖的提取及含量测定为探讨水溶性苜蓿多糖(WSAP)在不同提取环境中产率和含量的差异,为进一步研究WSAP的生物学功能和WSAP的工业化规模生产提供试验依据。本试验分别在实验室和工厂不同条件下采用水提醇沉脱蛋白的方法进行了WSAP的提取。(1)在实验室提取WSAP时高压(120~150kPa)煮沸,水提次数为2次,每次浸提时间为1h,两次浸提固液比分别为1:3和1:2时效果较好;在工厂提取过程时常压煮沸,水提次数为2次,每次浸提时间为1h,两次浸提固液比分别为1:8和1:6时效果较好。(2)在实验室条件下得到的WSAP提取率和含量均显著高于在工厂条件下得到的,在实验室条件下WSAP提取率为10. 75%,在工厂为5.72%;实验室提取得到的WSAP含量为82.13 %,工厂为45.84%。分析两种提取条件下WSAP提取率和含量的差异,可能是因为(1)实验室条件下原料的粉碎程度高可能会使多糖的提取率更高;另外,在工厂提取时大量水提药液随药渣流失,这也可能是造成在工厂提取WSAP提取率低的重要原因之一。(2)工厂条件下提取WSAP进行水提时地下水中的矿物质含量高,因此粗灰分含量(29.49%)远高于实验室提取WSAP中粗灰分的含量(6.24%)。(3)实验室WSAP提取时脱蛋白终点更能精确的判断,蛋白洗脱更彻底,所以粗蛋白的含量(5.99%)也低于工厂提取WSAP中粗蛋白的含量(13.98%)。以上结果表明,提取条件的不同可能会对多糖的提取率及含量产生显著的差异,提示在实际生产及实验中优化多糖提取工艺时,不仅要考虑浸提和浓缩的提取步骤,在原料的收集与处理,提取试剂和提取装置的合理利用方面也应进行研究改进,以期利用最低的能耗成本得到最高的产率。试验二:日粮中添加水溶性苜蓿多糖对肉仔鸡生长性能和免疫性能的影响试验选取1日龄肉仔鸡健康公雏240只,研究日粮中添加水溶性苜蓿多糖(WSAP)对肉仔鸡生长性能和免疫性能的影响。将肉仔鸡随机分为8个处理(对照组和7个WSAP的不同添加量组),每个处理设3个重复,每个重复10只鸡。试验分为两个阶段,0～3周为试验前期,4～6周为试验后期,进行生长性能和免疫性能相关指标的测定。结果表明:(1)各试验阶段,WSAP添加量为500 mg/kg时肉仔鸡的平均体重、平均日增重显著高于对照组(P<0.05),料肉比显著低于对照组(P<0.05)。(2)肉仔鸡日粮中添加一定剂量的WSAP组能够显著提高肉仔鸡免疫器官指数、显著提高新城疫抗体效价和血清中免疫球蛋白IgG水平,促进外周血T、B淋巴细胞增殖(P<0.05),且WSAP添加量为500mg/kg时效果最好。这些结果表明,日粮中添加一定剂量的WSAP可以显著促进肉仔鸡生长性能及免疫性能,且日粮中添加量为500mg/kg时效果最好。试验三:水溶性苜蓿多糖对肉仔鸡T、B淋巴细胞体外增殖的影响为探讨水溶性苜蓿多糖(WSAP)对体外培养的肉仔鸡淋巴细胞增殖的影响。本研究将不同浓度的WSAP分别加入到体外培养的用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的肉仔鸡外周血、胸腺、脾脏淋巴细胞中和用细菌脂多糖(LPS)刺激的肉仔鸡外周血、脾脏、法氏囊淋巴细胞中,培养48 h后用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定淋巴细胞增殖的变化。(1)在本试验中WSAP各剂量组的淋巴细胞增殖能力在一定浓度范围(4μg/mL~20μg/mL)内比对照组高,且随着多糖浓度的增加,数值先增高(1μg/mL~20μg/mL)后降低(100μg/mL~200μg/mL)。(2)同浓度WSAP对肉仔鸡外周血及不同的免疫器官的刺激强度不同,相同日龄条件下,肉仔鸡外周血和脾脏T、B淋巴细胞的增殖能力分别小于胸腺和法氏囊的增殖能力。(3)WSAP对相同日龄的肉仔鸡外周血及不同的免疫器官的最佳刺激浓度不同,对外周血的最佳刺激浓度为20μg/mL,脾脏为8μg/mL,法氏囊和胸腺为15μg/mL。本试验中WSAP对肉仔鸡体外淋巴细胞增殖的刺激浓度在8μg/mL、15μg/mL、20μg/mL时效果较好,这些结果表明一定浓度的WSAP可以促进肉仔鸡淋巴细胞的增殖,且存在一定的量效和组织特异性。试验四:水溶性苜蓿多糖对肉仔鸡淋巴细胞免疫调节作用的研究为探讨水溶性苜蓿多糖(WSAP)对体外培养的肉仔鸡淋巴细胞免疫调节作用的研究,以化学发光、信号分子NO、细胞因子IL-2、IL-6以及IFN-γ分泌为指标进行测定。本研究将不同浓度WSAP加入到肉仔鸡外周血、胸腺、脾脏、法氏囊淋巴细胞中,用生物化学发光测量仪测定淋巴细胞化学发光值;对分离的淋巴细胞置于24孔板中进行培养24h后离心吸取上清用硝酸还原酶法测定NO含量;将不同浓度的WSAP分别加入到体外培养的用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的肉仔鸡外周血、胸腺、脾脏淋巴细胞中培养24h后离心取上清液采用双抗夹心ELISA法检测。试验结果表明,(1)一定浓度的WSAP能够增强肉仔鸡外周血、脾脏、胸腺及法氏囊淋巴细胞的化学发光,可以促进各来源淋巴细胞NOS的表达,提高iNOS活性,并促进NO的产生,能够刺激肉仔鸡外周血、脾脏、胸腺淋巴细胞分泌IL-2、IL-6以及IFN-γ,随着WSAP浓度的升高,呈现先增高(1~20μg/mL )后降低(50~200μg/mL )的规律。(2)WSAP对不同的免疫组织器官最佳的刺激浓度不同,综合各检测指标,WSAP对外周血的最佳刺激浓度为15和20μg/mL,脾脏为8μg/mL ,胸腺为15μg/mL。(3)21日龄肉仔鸡淋巴细胞NO分泌量、NOS活性、IL-2、IL-6分泌量及对对WSAP的敏感性均高于42日龄肉仔鸡的相关指标的测定结果,但WSAP对肉仔鸡淋巴细胞刺激分泌IFN-γ的影响与此规律相反。综合分析,WSAP浓度在8、15、20μg/mL时,能够显著促进肉仔鸡淋巴细胞的化学发光,可以促进各来源淋巴细胞NOS的表达,提高iNOS活性,并促进NO的产生,能够刺激肉仔鸡外周血、脾脏、胸腺淋巴细胞分泌IL-2、IL-6以及IFN-γ,提示WSAP可能是通过这些途径来调控肉仔鸡淋巴细胞增殖,进而实现对机体的免疫调节作用的,是WSAP调节机体免疫力的可能机制之一。