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目的:原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见恶性肿瘤,分子靶向治疗被证实可显著改善晚期肝癌患者的预后。发现新的肿瘤调控分子对深入解析HCC的发病机制,寻找有效的治疗靶点至关重要。内质网跨膜蛋白166(transmembrane protein 166,TMEM166),在人胃癌、神经母细胞瘤等肿瘤中具有重要的抑癌功能,主要通过影响细胞自噬和细胞凋亡发挥作用,然而TMEM166在HCC中的功能及机制尚不清楚;研究表明多种microRNA在HCC中上调参与HCC的发生发展,TMEM166在HCC中的表达下调是否受microRNA分子的调控,这一问题的解答将有助于HCC发病机制的阐明。本研究将对TMEM166在肝细胞癌中的功能和机制进行探讨,并从上游micro RNA角度对其表达调控机制进行初步的解析。方法:首先通过生物信息学方法对TCGA数据库中TMEM166在HCC中的表达和临床意义进行相关性分析;收集30例病人样本,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫组化、蛋白质免疫印迹法检测和验证TMEM166在HCC组织和成对癌旁组织中的表达,并在正常肝细胞系和HCC细胞系进行表达谱确认。其次,功能研究采用过表达法,在HCC细胞系(Huh7、Hccl-M3、QGY-7703)中过表达TMEM166,MTT法、细胞划痕法、Transwell法分别检测其对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响;DAPI染色法及流式细胞仪检测其对肝癌细胞凋亡、细胞周期的影响。再次,蛋白质免疫印迹法检测其对凋亡、周期相关蛋白p53、BAX、BCL-2、p21表达和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响。最后,在表达调控方面借助生物信息学手段预测调控TMEM166表达的microRNA,随机选取10对组织样本,实时荧光定量PCR法筛选预测出的microRNA,最后通过双萤光素酶实验确定其真正的靶向microRNA。结果:TCGA数据分析显示,TMEM166在人HCC组织中的表达较正常组织显著降低,TNM III期之前,其低表达与患者的疾病进展及生存期缩短显著相关。病人样本检测结果显示,肝癌组织TMEM166 mRNA及蛋白的表达水平均显著低于成对癌旁组织(P<0.001)。肝癌细胞(Huh7、Hccl-M3、QGY-7703)中TMEM166 mRNA及蛋白表达水平均显著低于正常肝细胞L02(P<0.001)。TMEM166过表达显著抑制了肝癌细胞的增殖(P<0.01)、迁移(P<0.05)和侵袭(P<0.01);造成肝癌早期凋亡和细胞周期阻滞(P<0.05)。TMEM166过表达上调了抑癌基因p53,引起促凋亡蛋白BAX表达水平明显升高,抗凋亡蛋白BCL-2表达水平明显下降,诱发细胞凋亡;同时引起细胞周期抑制因子p21的表达水平明显升高,诱发细胞周期阻滞;引起EMT相关蛋白E‐cadherin的表达水平明显上升,N‐cadherin和Vimentin的表达水平明显下降,导致EMT阻断。生物信息学预测结合实时荧光定量PCR法筛选结果显示,miR-107、miR-103a-3p、miR-1250-3p在HCC患者癌组织中表达上调,双萤光素酶检测结果显示,miR-103a-3p、miR-1250-3p是TMEM166的上游靶向microRNA。结论:我们的研究首次全面分析了TMEM166在HCC中的作用。TMEM166的低表达与HCC的发展和不良预后相关。TMEM166在肝细胞癌组织和细胞系中较正常组织和肝细胞显著下调。TMEM166对肝癌细胞具有良好的抗肿瘤活性,通过在肝癌细胞中诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期和抑制EMT抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭发挥抑癌作用。miR-103a-3p、miR-1250-3p是靶向TMEM166的上游miRNA,在HCC中下调TMEM166的表达,可能是肝癌发生的一个机制。TMEM166是治疗HCC的潜在靶点。