【摘 要】
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冠突曲霉(Aspergillus cristatus)是茯砖茶发花过程中的优势菌,其产生的闭囊壳俗称“金花”,“金花”的数量在茯砖茶的品质判断中起着重要的作用。实验前期研究发现,在高渗透压下,冠突曲霉相较于其他丝状真菌而言,更容易获得纯的有性孢子。因此,冠突曲霉是研究丝状真菌有性产孢机制的良好材料,闭囊壳作为判断茯砖茶品质的重要条件和冠突曲霉有性发育过程中的重要结构,该结构对开发茯砖茶的生产实践和
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冠突曲霉(Aspergillus cristatus)是茯砖茶发花过程中的优势菌,其产生的闭囊壳俗称“金花”,“金花”的数量在茯砖茶的品质判断中起着重要的作用。实验前期研究发现,在高渗透压下,冠突曲霉相较于其他丝状真菌而言,更容易获得纯的有性孢子。因此,冠突曲霉是研究丝状真菌有性产孢机制的良好材料,闭囊壳作为判断茯砖茶品质的重要条件和冠突曲霉有性发育过程中的重要结构,该结构对开发茯砖茶的生产实践和丝状真菌有性产孢机制的研究方面具有重要意义。在曲霉有性发育研究过程中,imeB基因对曲霉闭囊壳的发育起正调控作用;ppgA基因作为信息素前体基因响应G蛋白偶联受体与其下的MAKP途径,G蛋白偶联受体和MAKP途径在曲霉的产孢过程中起非常作用的作用。因此推测imeB和ppgA基因参与了冠突曲霉有性发育过程。本研究以实验室保藏的Ku70菌株为材料,研究结果如下:1)通过生物信息学分析imeB和ppgA基因序列。imeB基因(SI65_05226)序列全长为1541 bp,含1个内含子,内含子长度81 bp,m RNA序列长度1461bp,编码487个氨基酸,氨基酸序列结构包含12个螺旋结构,编码的蛋白属于MFS超家族蛋白。ppgA基因(SI65_03062)全长330 bp,不含内含子,m RNA序列长度330 bp,编码110个氨基酸。2)通过基因敲除技术获得ppgA基因敲除转化子3株(△ppgA-14,△ppgA-38,△ppgA-56)。形态学研究发现:ppgA敲除株在含不同NaCl浓度的MYA培养基上28℃培养8天,其中0、1、2 mol/L NaCl浓度下,敲除株菌落菌丝较厚,菌落颜色浅黄色,敲除株只在1 mol/L NaCl浓度下才有闭囊壳产生,闭囊壳的产量低于对照株。数据统计,ppgA敲除株的闭囊壳产量约3个/4mm~2,对照株闭囊壳产量约44个/4mm~2,ppgA敲除株的闭囊壳数量相较于对照株减少约为15倍。说明ppgA基因的缺失会减少冠突曲霉闭囊壳的产量,大量减少冠突曲霉有性发育过程中闭囊壳的形成,ppgA基因与闭囊壳的形成成正相关。其中ppgA缺失会减缓冠突曲霉的生长速率,对其无性产孢也有一定的影响。3)获得imeB基因敲除转化子4株(△imeB-10,△imeB-16,△imeB-17,△imeB-19)。形态学观察发现:imeB基因敲除株在37℃培养8天,在MYA培养基上菌落中央偏黑色;1 mol/L NaCl浓度下,imeB敲除株和对照株菌落都为金黄色,且有大量闭囊壳产生;在2 mol/L NaCl浓度下,imeB敲除株菌落中央产生气生菌丝,形成气生菌丝层,敲除株和对照株菌落中央都有分生孢子产生。imeB敲除株闭囊壳的数量和分生孢子的数量都有所减少。4)通过基因过表达技术获得ppgA基因过表达菌株1株,形态学观察发现,在含5%NaCl的MYA培养基上,ppgA基因过表达菌株闭囊壳较大、成熟期减短,子囊孢子的产量增加了2.81倍。
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